鄭杰，劉英麗，康進(jìn)生，崔雪花，桑琳霞，李文玲

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，石家莊 050017；3.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)外二科，石家莊 050051）

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）臨床較少見，但近年其發(fā)病率呈增高趨勢且預(yù)后不佳［1-3］。絕大多數(shù)PCNSL屬于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，好發(fā)部位包括基底節(jié)區(qū)、胼胝體、額葉或腦室周圍結(jié)構(gòu)，也可發(fā)生于眼部、腦膜和脊髓。到目前為止，其發(fā)病機制仍不十分清楚，多發(fā)生于免疫功能缺陷人群［4］。有研究［5］認(rèn)為，一些遺傳因素可能作為其發(fā)病和預(yù)后的標(biāo)志物。泛素特異性蛋白酶22（ubiquitin-specific protease 22，USP22）是一種新的腫瘤標(biāo)志基因［6-7］，是新發(fā)現(xiàn)的一種人類去泛素酶，可表達(dá)于早期胚胎以及成人的各種組織中［8］。USP22是hSAGA的重要組成部分，通過對組蛋白H2A和H2B的去泛素化調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，而這些下游基因與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［6，9-12］。USP22的表達(dá)水平可以預(yù)測許多腫瘤的不良預(yù)后和治療失敗，如鼻咽癌、肝癌、胃癌等［13］。目前，USP22與PCNSL的關(guān)系還不清楚。因此，本研究主要探討了USP22在PCNSL預(yù)后中的作用，為今后的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 病例收集

收集2010年1月至2016年1月于河北省人民醫(yī)院神經(jīng)外二科就診、術(shù)后病理證實并進(jìn)行放化療的48例PCNSL患者的腦組織標(biāo)本（PCNSL組織），同時收集27例腦挫裂傷患者挫傷灶腦組織標(biāo)本（挫傷灶腦組織），所有組織均在手術(shù)過程中收集并及時放于液氮中保存。本研究所有患者均簽署知情同意書，并通過倫理委員會審核。

1.2 RNA提取和實時定量PCR檢測USP22 mRNA表達(dá)

采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法檢測USP22基因在48例PCNSL組織和27例挫傷灶腦組織中的表達(dá)情況。采用Trizol（美國Invitrogen公司）提取腦組織中的總RNA，并用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后用Trans Start Top Green qPCR SuperMix［天根生化科技（北京）有限公司］試劑盒進(jìn)行實時定量PCR。USP22引物：正向5’-TCAC CTCGAACTGCACCATA-3’，反 向5’-GAAGAAGTCCC GCAGAAGTG-3’。每個反應(yīng)的終體積為20 μL，包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，8 μL水。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 5 s，56 ℃15 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。

1.3 Western blotting檢測USP22蛋白表達(dá)

用凍存的PCNSL組織和挫傷灶腦組織提取總蛋白，并用Western blotting檢測不同組織中USP22蛋白的表達(dá)情況。首先用SDS-PAGE分離總蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后用抗USP22抗體（1∶500，美國Abcam公司）4 ℃過夜孵育，用0.1%TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min；加入倍稀釋的抗兔熒光抗體（1∶10 000，美國Abcam公司），避光室溫孵育1 h，0.1% TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。應(yīng)用Odyssey V3.0軟件對Western blotting條帶進(jìn)行定量分析。

1.4 治療與隨訪

PCNSL患者術(shù)前均行頭MRI（平掃+強化）檢查，明確病灶部位、數(shù)量和大小后行立體定向穿刺活檢，病理證實為PCNSL。治療方案采用化療+放療。所有患者跟蹤隨訪至2018年1月。所有相關(guān)信息均來自河北省人民醫(yī)院神經(jīng)外二科的病歷記錄，記錄患者總生存期，進(jìn)行預(yù)后分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗進(jìn)行比較。計量資料以或M（P25～P75）表示，采用t檢驗進(jìn)行比較。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，采用Cox模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床和病理特征

本研究共納入48例PCNSL患者，中位年齡52.4（28～74）歲。其中30例（62.5%）主要表現(xiàn)為頭痛、頭暈等顱高壓癥狀，12例（25.0%）表現(xiàn)為肢體乏力、輕偏癱等局灶性神經(jīng)功能缺失癥狀，6例（12.5%）表現(xiàn)為情感障礙、記憶力減退等精神癥狀。按照不同年齡、不同性別等臨床特征進(jìn)行比較（表1），結(jié)果顯示，USP22蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小及病灶數(shù)量有關(guān)（P＜0.05），腫瘤直徑越大、病灶數(shù)量越多，則USP22蛋白表達(dá)水平越高，而與年齡、性別等其他臨床特征無關(guān)（P＞0.05）。

2.2 治療和預(yù)后

PCNSL患者化療方案為大劑量甲氨蝶呤單藥化療，中位療程6（3～8）個療程。放療采用全腦放療或局部放療，中位放療劑量30（19～60）Gy。平均生存期為（26.27±12.39）個月。

2.3 PCNSL組織與正常腦組織中USP22 mRNA和蛋白的表達(dá)差異

采用qRT-PCR檢測PCNSL組織和挫傷灶腦組織標(biāo)本中USP22mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PCNSL組織USP22mRNA的表達(dá)水平明顯高于挫傷灶腦組織（P＜0.001，圖1A），說明USP22作為腫瘤標(biāo)志物的重要性；PCNSL組織USP22蛋白表達(dá)水平也明顯高于挫傷灶腦組織（圖1B）。

2.4 USP22表達(dá)對PCNSL預(yù)后的影響

以各標(biāo)本中USP22蛋白的表達(dá)水平平均值為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)USP22蛋白的表達(dá)水平將PCNSL分為低表達(dá)組（蛋白表達(dá)水平低于平均值，n=22）和高表達(dá)組（蛋白表達(dá)水平高于平均值，n=26）。Kaplan-Meier分析結(jié)果（圖2）顯示，在經(jīng)過放化療后的PCNSL患者中，USP22表達(dá)水平越高，預(yù)后越差。Cox回歸分析（表2）顯示，USP22蛋白表達(dá)水平是PCNSL的一個獨立預(yù)后影響因素，USP22表達(dá)水平越高，預(yù)后越差（P＜0.05）；同時，病灶數(shù)量也是一個獨立影響預(yù)后的因素，病灶數(shù)量越多，預(yù)后越差（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，USP22的高表達(dá)與PCNSL的發(fā)展進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)。

表1 USP22蛋白表達(dá)水平與PCNSL患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 USP22 protein expression and the clinical characteristics of patients with PCNSL

圖1 USP22在PCNSL組織和挫傷灶腦組織中的表達(dá)情況Fig.1 USP22 expression in PCNSL tissues and brain tissues with contusion

圖2 PCNSL患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier estimate of patients with PCNSL

3 討論

PCNSL是一種發(fā)病率較低但預(yù)后較差的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［14-15］。目前，一些臨床和病理指標(biāo)仍不能很好的預(yù)測其預(yù)后。因此，急需尋找新的診斷標(biāo)志物以便制定治療策略、預(yù)測治療效果。近年來人們更多的關(guān)注腫瘤表觀遺傳學(xué)，尤其是基因標(biāo)志物對腫瘤治療效果和預(yù)后的評估作用［16］。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)主要參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解代謝、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等多種細(xì)胞過程［16］。其泛素化過程具有可逆性，即通過去泛素化酶對底物蛋白的去泛素化調(diào)控蛋白質(zhì)的壽命或功能。因此，去泛素化酶在維持細(xì)胞正常功能和某些病理過程中發(fā)揮重要作用。去泛素化酶分為6大類，泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitin-specific protease，USP）是目前去泛素化酶中成員最多、結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類［16］，其中以USP22最為重要。正常生理狀態(tài)下，USP22廣泛表達(dá)于人體各種不同組織，其中以骨骼肌和心臟表達(dá)最多，腦、腎臟和胰腺表達(dá)中等，肺和肝臟表達(dá)最少。目前研究［17-18］已經(jīng)證實，USP22是一個重要的腫瘤標(biāo)志基因，在許多腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，可以作為一些腫瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。但是其與PCNSL的關(guān)系還鮮有報道。因此，本研究的主要目的是探討USP22在PCNSL的發(fā)展和預(yù)后中的作用，為今后的治療提供新的靶點。

表2 影響PCNSL患者生存的Cox多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the survival of patients with PCNSL using Cox model

本研究共選擇了48例PCNSL患者作為病例組，利用立體定向技術(shù)獲取PCNSL組織標(biāo)本，采用qRT-PCR檢測USP22mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PCNSL組織標(biāo)本中USP22mRNA的表達(dá)水平高于挫傷灶腦組織。同時采用Western blotting分析USP22蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PCNSL組織USP22蛋白的表達(dá)水平高于挫傷灶腦組織，與USP22mRNA的結(jié)果一致。而且USP22蛋白的高表達(dá)與病灶數(shù)量增多呈正相關(guān)。既往研究［17-18］表明，USP22可通過調(diào)節(jié)Survivin影響細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后；可通過上調(diào)叉頭框蛋白M1表達(dá)，促進(jìn)β連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)位，促使G1/S期細(xì)胞增多；通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移；通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)STAT、TGF-β等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤的發(fā)生過程。結(jié)合本研究結(jié)果，表明USP22在PCNSL的發(fā)生、發(fā)展過程中起到促進(jìn)作用，其作用機制可能與文獻(xiàn)報道相符。

為了進(jìn)一步驗證USP22蛋白表達(dá)與PCNSL預(yù)后的關(guān)系，本研究采用Kaplan-Meier分析驗證USP22蛋白的高表達(dá)對放化療后患者預(yù)后的影響。結(jié)果證實，USP22蛋白表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差。同時采用Cox回歸模型進(jìn)一步分析了影響PCNSL預(yù)后的因素，結(jié)果證實，USP22是一個獨立影響PCNSL預(yù)后的因素。這些結(jié)果表明，USP22蛋白的高表達(dá)可以影響PCNSL的進(jìn)程，降低放化療治療效果，造成患者預(yù)后不良，這與其在其他腫瘤中的作用一致。

總之，本研究證實了USP22可以促進(jìn)PCNSL的進(jìn)程，其高表達(dá)可引起患者預(yù)后不良，因此USP22可作為今后PCNSL的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物，但其功能和分子機制仍不十分清楚，需要進(jìn)一步的研究來確定其具體的調(diào)控機制，為PCNSL的診斷和治療提供新的靶點和方向。