白磊鵬 呂家興 李哲宏 孔令偉 曹海營 金 宇

骨與軟組織肉瘤均來源于間葉組織，其轉(zhuǎn)移方式幾乎都是血道擴散，肺因為雙重血供的特殊解剖結(jié)構(gòu)，是骨與軟組織肉瘤早期轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位[1, 2]。惡性骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移率高達1%～9%，高度惡性的骨原發(fā)性肉瘤患者在確診時15%～20%肺部有微小轉(zhuǎn)移病灶[3, 4]。臨床中對于骨與軟組織肉瘤的治療，尤其是出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的患者，需要多學科聯(lián)合治療，延長生存時間，但此類患者的預后都較差[5]。由于骨與軟組織肉瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者病情十分復雜，涉及多個系統(tǒng)，在基礎實驗中缺乏理想的骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型，導致骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移的相關研究較少見。因此，建立一種穩(wěn)定的惡性骨腫瘤的肺轉(zhuǎn)移動物模型對于研究其發(fā)生機制、生物學特性、治療方法等具有十分重要的意義。

目前，骨腫瘤常用的動物模型有小鼠模型、裸鼠模型等，而大型哺乳類動物模型常用兔VX2骨腫瘤模型[6～8]。理想的惡性骨腫瘤的肺轉(zhuǎn)移模型應與人類的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生的機制相同或接近，在局部浸潤、轉(zhuǎn)移方式等方面具有代表性，且對于肺部的觀察簡便易行。VX2腫瘤細胞是由Shope病毒誘導的人乳頭瘤來源的鱗狀細胞癌，經(jīng)過72代移植后形成[9]。大量研究表明，兔VX2肝腫瘤生長迅速，可以接種到肺、肝、肌肉或骨骼[10]。VX2兔骨腫瘤模型具有人類惡性骨腫瘤類似生物學特性，可用于模擬人骨腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過程[11]。因此，本研究選擇在制作兔VX2骨腫瘤動物模型的基礎上，探究一種建立骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移的動物模型的方法，以精準地體現(xiàn)骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程，可以更好地了解其生物學特性，為今后的相關研究提供參考。

材料與方法

1.動物和瘤株:普通級日本大耳白兔31只，雌雄不限，月齡2.5個月，體質(zhì)量2.0～2.5kg。購自北京市昌揚西山養(yǎng)殖場，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0007。所有實驗兔喂養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃，濕度為50%。維持12/12h的光/暗周期，室內(nèi)通風良好，食物和水的獲取受到限制(每天2次)。VX2腫瘤細胞株購自重慶蒙博生物科技有限公司，實驗地點為承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室。本研究遵循承德醫(yī)學院實驗動物保護和使用要求，遵循醫(yī)學倫理學要求。

2.VX2腫瘤組織塊的制備：在常溫常壓環(huán)境中，由兩名實驗員將VX2腫瘤細胞組織植入1只日本大耳白兔左大腿肌肉處。3周后，腫瘤生長至3cm×3cm×3cm腫塊。經(jīng)耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，以兔角膜反射消失為麻醉成功標志。去除腫瘤區(qū)兔毛，俯臥位固定于動物實驗操作臺上，碘伏消毒術(shù)區(qū)，鋪蓋無菌孔巾，切開皮膚，分離皮下組織、腫瘤。將腫瘤完整取出后移至無菌工作臺上，置于37℃的PBS中清洗3遍，去除腫瘤中血跡、壞死組織和纖維組織，眼科剪將腫瘤剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，置于含10%的胎牛血清中，常溫常壓下臨時存放備用。

3.VX2骨腫瘤模型的制作:30只日本大耳白兔術(shù)前4h禁食水，經(jīng)耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，后肢備皮仰臥位固定于操作臺上，碘伏消毒3遍后鋪無菌孔單。選取左側(cè)膝關節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚做一1cm長切口，逐層切開皮下組織和筋膜，暴露髕韌帶，縱行鈍性分離髕韌帶，顯露脛骨平臺，在脛骨平臺面用1mm克氏針鉆孔，用頂棒將體積為1mm3的VX2腫瘤組織塊沿套管推入脛骨髓腔內(nèi)，拔出套管，骨蠟封堵骨孔，無水乙醇沖洗骨孔周圍組織3遍，每次保留無水乙醇浸泡1min以上，兩側(cè)髕韌帶縫合重建后，逐層縫合切口,模型制作完成?？p合后連續(xù)3天大腿肌內(nèi)注射青鏈霉素混懸液預防感染，模型制作完成。以上操作于中心實驗室動物實驗間完成，實驗間設備及環(huán)境由專業(yè)人員定時清理消毒。

4.局部轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的觀察：在建模完成后，每周對左側(cè)脛骨進行1次X線檢查，連續(xù)2周。由高年資骨腫瘤臨床醫(yī)生做出評估，腫瘤生長速度，骨皮質(zhì)破壞及局部轉(zhuǎn)移顯影情況與臨床患者表現(xiàn)差異。第1周隨機選取15只家兔1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖獲取肺臟大體病理標本，由病理科醫(yī)生進行固定、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。鏡下觀察VX2腫瘤在肺組織中表現(xiàn)與周圍正常組織的關系。第2周同樣方法處死剩余家兔后取材后經(jīng)HE染色鏡檢。取材操作于中心實驗室動物實驗間完成，HE染色及鏡檢由醫(yī)院病理科醫(yī)生于病理實驗室完成。

結(jié) 果

30只家兔肺中均出現(xiàn)腫瘤組織，建模成功率100%。30只家兔第1周脛骨X線顯示腫瘤在髓內(nèi)生長迅速，出現(xiàn)骨膜反應；第2周3只家兔腫瘤浸潤至骨外。大體解剖可見，第1周，15只家兔全部可在肺部見多發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)，主要分布在肺部邊緣處，從肺邊緣向肺門逐漸減少；第2周，15只家兔全部肺部布滿腫瘤結(jié)節(jié)，明顯多于第1周。HE染色鏡下，腫瘤細胞在肺臟中聚集成巢，結(jié)節(jié)中心為壞死細胞，周圍為核大深染的腫瘤細胞和炎性細胞，腫瘤細胞與正常肺組織間邊界不清晰(圖1)。

討 論

骨與軟組織肉瘤是來源于骨骼、肌肉、脂肪、血管及纖維結(jié)締組織等間葉組織的惡性腫瘤，肺是骨與軟組織肉瘤最常見的轉(zhuǎn)移部位[12, 13]。骨與軟組織肉瘤早期幾乎全部經(jīng)血源性擴散轉(zhuǎn)移到肺部。據(jù)相關報道，15%～20%的骨與軟組織肉瘤患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移者可達90%[14, 15]。發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的惡性骨腫瘤患者的預后極差，這種結(jié)果一方面是由于惡性腫瘤復雜的生物學特性引起的，另一方面顯示了目前對于惡性骨腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移的研究不足[16]。

圖1 骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型的制作和檢測A.經(jīng)脛骨種植VX2腫瘤；B.第1周X線示腫瘤在髓腔內(nèi)生長，破壞骨皮質(zhì)；C.第2周X線示腫瘤浸潤至骨外；D.第1周，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)分布從肺邊緣至肺門逐漸減少；E.第2周，P肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)布滿全肺；F.鏡下正常肺組織(HE,×40)；G.第1周肺組織腫瘤結(jié)節(jié)(HE,×40)；H.第2周肺組織腫瘤結(jié)節(jié)(HE,×40)

目前，臨床中治療骨與軟組織肉瘤肺轉(zhuǎn)移的方法主要有外科手術(shù)切除、局部消融、放療、化療、分子靶向治療以及最新興起的免疫治療等[17]。這些治療大多具有良好的近期效果，但是遠期療效尚未有明顯的改善。因此，建立符合人類骨與軟組織肉瘤肺轉(zhuǎn)移的動物模型可以精準地體現(xiàn)腫瘤在病患體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展過程，可以更好地了解腫瘤肺轉(zhuǎn)移的生物學特性，對于制定個體化治療方案及腫瘤肺轉(zhuǎn)移的基礎和臨床研究具有重要意義。理想的骨與軟組織肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型，應與人類的肺轉(zhuǎn)移過程具有相同或相近的生物學行為，在局部擴散、遠處轉(zhuǎn)移、肺部浸潤等方面提供臨床研究價值。研究表明，兔VX2腫瘤生長迅速，可以接種至骨骼制成惡性骨腫瘤動物模型。同時，VX2腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到肺部后可以早期產(chǎn)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11, 18]。這表明VX2兔骨腫瘤模型具有相關生物學特性，可用于模擬人轉(zhuǎn)移性骨腫瘤。

兔脛骨VX2骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型的優(yōu)點：①操作簡便，時間短；②創(chuàng)傷?。虎鄯尾繜o損傷；④自發(fā)轉(zhuǎn)移過程符合腫瘤特性；⑤成模率高。以往的肺部植瘤模型，需要根據(jù)肺部解剖對植瘤部位和方式進行嚴密操作，植瘤術(shù)后并發(fā)癥高，易造成動物死亡。而兔脛骨VX2骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型不需要對肺部進行操作，只需在脛骨植入腫瘤，隨著腫瘤的自發(fā)轉(zhuǎn)移過程，1周即可獲得肺轉(zhuǎn)移瘤模型，其操作步驟十分簡單，手術(shù)創(chuàng)傷也僅在脛骨植瘤部位留下1cm左右的切口，手術(shù)不會對肺部造成損傷。腫瘤肺轉(zhuǎn)移的過程是腫瘤生物學特性的表現(xiàn)，避免了肺部植瘤的手術(shù)干擾因素。更小的創(chuàng)傷使得動物更易耐受手術(shù)操作，降低了動物的死亡率，因此成模率極高，本實驗中，30只家兔全部建模成功，已證明了這一點。對植瘤的脛骨X線檢查發(fā)現(xiàn)，在第1周時，腫瘤在髓腔內(nèi)迅速生長，并且出現(xiàn)骨膜反應；第2周時，部分家兔脛骨中腫瘤已浸潤至骨外，擴散到周圍軟組織中。通過大體解剖發(fā)現(xiàn)，在第1周時，盡管腫瘤還在髓腔內(nèi)生長，但是肺部已經(jīng)出現(xiàn)肺緣分布的腫瘤結(jié)節(jié)，而第2周時，腫瘤基本上布滿全肺。病理切片鏡下觀察，可見肺組織中成團落聚集的腫瘤結(jié)節(jié)，HE 染色中心區(qū)域為壞死細胞，呈嗜堿性紅染，外周表現(xiàn)為濃染的腫瘤細胞、結(jié)締組織和炎性細胞，這與以往研究中的VX2腫瘤細胞的鏡下表現(xiàn)相同[19]。

總結(jié)本方法建模的經(jīng)驗：①簡化操作，減小創(chuàng)傷，可以極大提高動物植瘤后的成活率；②通過向脛骨內(nèi)植入較大的腫瘤組織塊，可以加速腫瘤生長，更快獲得肺轉(zhuǎn)移模型；③通過脛骨植瘤的肺轉(zhuǎn)移模型，可以避免種植瘤的局部浸潤影響對遠處轉(zhuǎn)移的觀察；④腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移是一個動態(tài)的過程，該生物學行為在植瘤后第1周內(nèi)即可發(fā)生。

綜上所述，本研究采用經(jīng)脛骨移植VX2腫瘤組織塊，建立兔脛骨骨腫瘤模型，腫瘤在脛骨髓腔內(nèi)生長至一定程度后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，形成肺轉(zhuǎn)移瘤模型，該方法避免了肺部的損傷，保留了肺部的完整結(jié)構(gòu)，且獲得的病理標本均為多發(fā)的肺腫瘤結(jié)節(jié)，這與臨床中肺轉(zhuǎn)移瘤的特性相同，可以較為真實地研究惡性骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移的生物學行為[20]。該模型制作方法簡單，成功率高，在構(gòu)建途徑、生長方式和病理上均接近于人類惡性骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移過程，能全面表現(xiàn)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移全過程，值得在基礎研究中推廣。

本研究的不足之處在于缺乏肺部完整的影像學資料。VX2腫瘤細胞雖然是基礎研究較為成熟的造模瘤株，但惡性骨腫瘤多為間葉組織來源，而VX2腫瘤細胞是鱗狀細胞癌，其生物學特性與惡性骨腫瘤比較，仍存在許多差異，因此本研究僅對制作骨腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型的方法具有一定的參考價值，而對于惡性骨腫瘤的肺轉(zhuǎn)移參考價值有限。