張晶晶 李 蕾 彭 澎 沈鏗

雖然卵巢癌的發(fā)生率居?jì)D科惡性腫瘤第3位，但病死率卻居首位。卵巢癌癥狀無特異性，CA125作為其腫瘤標(biāo)志物仍不夠理想，約70%患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期。卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是手術(shù)及以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但這只能有效治療部分早期患者，大多數(shù)晚期患者常在短暫的無病間期后面臨疾病復(fù)發(fā)。外泌體基礎(chǔ)研究的開展和深入揭開了其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。近些年開展了將外泌體應(yīng)用于卵巢癌診斷和治療的探索，本文對此進(jìn)行綜述。

一、外泌體概述

細(xì)胞向外分泌的囊泡根據(jù)最大直徑分為凋亡小體、微囊泡和外泌體，其中外泌體是最小的細(xì)胞外囊泡，直徑30～100nm，密度1.13～1.19g/ml，透射電鏡下呈杯狀，低溫電子顯微鏡下呈圓形[1]。

最初，外泌體發(fā)現(xiàn)于網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放膠體金標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白過程中?，F(xiàn)已明確外泌體的形成過程分為如下幾步：①細(xì)胞膜內(nèi)陷形成含有膜表面蛋白及脂類的早期內(nèi)涵體；②進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的早期內(nèi)涵體再次向內(nèi)凹陷包裹細(xì)胞質(zhì)中漂浮的蛋白和RNAs，此時形成多囊泡體；③多囊泡體與細(xì)胞膜融合，以類似胞吐的形式將其中的小囊泡釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，至此外泌體形成[2]。眾多細(xì)胞可分泌外泌體，如樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)元、血小板、腸上皮細(xì)胞等，因此，外泌體廣泛存在于血漿、唾液、尿液、羊水、腹腔積液、乳汁等各種體液中[3]。

外泌體最重要的作用是參與細(xì)胞間通訊，其攜帶多種細(xì)胞表面分子，能同時與許多不同的細(xì)胞受體結(jié)合，還可通過直接融合以及細(xì)胞內(nèi)吞將其攜帶的生物活性物質(zhì)送入受體細(xì)胞內(nèi)，如傳遞腫瘤細(xì)胞的致癌基因、傳播病原體等；此外，外泌體還參與免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞程序性死亡、血管生成、炎癥、凝固等過程[4]。

外泌體通常攜帶了大量蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、長鏈非編碼RNA、脂類等，偶爾可見基因組DNA。截止2014年，據(jù)統(tǒng)計(jì)所有不同來源的外泌體包含4563種蛋白質(zhì)，1639種mRNA和764種microRNA以及194種脂質(zhì)，而這一數(shù)據(jù)還在增長[5]。由于外泌體起源于細(xì)胞膜，因此外泌體所有外泌體均攜帶參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合的蛋白質(zhì)(GTP酶、膜聯(lián)蛋白、脂閥結(jié)構(gòu)蛋白)、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、熱休克蛋白(Hsc70、Hsp90)、參與產(chǎn)生多囊泡體的蛋白(Alix、TSG101)、脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶[6]。此外，外泌體還攜帶細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)，參與對應(yīng)的生理病理過程，如對鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體含有annexin A3，此蛋白質(zhì)參與卵巢癌細(xì)胞的鉑流出過程[7]。

目前，對外泌體RNAs的研究主要集中在mRNA和microRNA。2007年的一項(xiàng)研究首次揭示外泌體中含有mRNA和microRNA，并發(fā)現(xiàn)通過外泌體轉(zhuǎn)移的mRNA可以在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[8]。外泌體攜帶的microRNA也具有特異性，如通常在惡性腫瘤中升高的miR-21，在卵巢癌源性外泌體中的含量較其他卵巢良性疾病來源的外泌體中的含量要明顯升高[9]。外泌體攜帶的脂類也與其最主要的細(xì)胞間通訊功能相符。外泌體富含的脂質(zhì)為一些筏相關(guān)脂質(zhì)，如神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、磷酸甘油酯、膽固醇等，其中膽固醇主要存在于B淋巴細(xì)胞來源的外泌體，這提示不同細(xì)胞來源的外泌體所富含的脂質(zhì)成分也是有差別的[6]。

二、提取外泌體的技術(shù)難點(diǎn)

提取高純度外泌體的難點(diǎn)在于：①微囊泡的直徑為100～1000nm，容易與外泌體混淆；②不同細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡混合于細(xì)胞外間隙；③單細(xì)胞可以分泌不同細(xì)胞內(nèi)來源的外泌體。提取高純度外泌體的最佳方法還在探索中。差異超速離心法是最早使用的方法，也是目前最廣泛使用的方法，通常與蔗糖墊或蔗糖密度梯度離心法聯(lián)合使用。但該方法缺點(diǎn)頗多，包括步驟繁瑣、耗時耗力、處理樣本量小、外泌體產(chǎn)量少、實(shí)驗(yàn)耗材多等，難以在臨床大規(guī)模推廣使用[6]。很多人嘗試使用其他方法包括超濾聯(lián)合排阻色譜法、聲納濾技術(shù)等以提取高純度外泌體，但技術(shù)尚不純熟[10,11]。目前，也有提取外泌體的商品化試劑盒，采用親和性膜離心柱純化外泌體，在此基礎(chǔ)上利用QIAzol細(xì)胞溶解試劑裂解外泌體獲得其內(nèi)RNA[12]。雖然，商品化試劑盒能夠快速、便利地獲得結(jié)果，但價格昂貴。

三、外泌體在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用

惡性腫瘤由腫瘤細(xì)胞及腫瘤基質(zhì)組成，腫瘤基質(zhì)由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞外囊泡形成復(fù)雜腫瘤微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞釋放外泌體是向腫瘤微環(huán)境傳遞信號的一種方式。腫瘤細(xì)胞所釋放的外泌體的數(shù)量以及外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和microRNA的量較正常細(xì)胞均更多[13]。外泌體作用于在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個階段，包括誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、侵襲和轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤血管生成等。

有研究發(fā)現(xiàn)卵巢漿液性癌外泌體中的miR-21通過下調(diào)抑癌基因——細(xì)胞程序性死亡基因-4的表達(dá)以促進(jìn)靶細(xì)胞發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)化[14]。卵巢癌外泌體或直接或間接地參與免疫調(diào)節(jié)過程。卵巢癌患者腹腔積液中的外泌體在樹突狀細(xì)胞存在時，可損傷外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[3]。卵巢乳頭狀漿液腺癌來源外泌體內(nèi)含F(xiàn)asL，可直接誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[15]。

不同病理類型卵巢癌細(xì)胞甚至同一病理類型不同個體的卵巢癌細(xì)胞侵襲能力不同，體現(xiàn)在外泌體所攜帶的與侵襲能力相關(guān)的生物活性物質(zhì)上。卵巢癌細(xì)胞的向外遷移，最先通過腹腔積液循環(huán)播散至腹腔，卵巢癌細(xì)胞能夠通過外泌體向腹膜間皮細(xì)胞傳遞CD44，繼而促使腹膜間皮細(xì)胞通過分泌MMP9和清除間皮障礙來提高細(xì)胞的侵襲性[16]。LIN28是一種RNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)mRNA和microRNA，與人類晚期惡性腫瘤相關(guān)，且常表達(dá)于卵巢腫瘤中。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含大量LIN28的人類卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體能增加HEK293細(xì)胞的上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)其侵襲和遷移[17]。外泌體對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響并非單向，有實(shí)驗(yàn)揭示上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)對腫瘤細(xì)胞遷移起到促進(jìn)還是抑制作用取決于腫瘤類型，在人類上皮性卵巢癌中為抑制細(xì)胞遷移作用[18]。

外泌體還多方參與卵巢癌耐藥形成。溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸金屬的集裝箱，起到接收、儲存、分配金屬的作用。在鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，其溶酶體體積較鉑類敏感的卵巢癌細(xì)胞明顯縮小，是因?yàn)槿苊阁w內(nèi)的溶酶體相關(guān)蛋白1(lysosome-associated proteins-1，LAMP1)減少，但細(xì)胞釋放的外泌體中LAMP1、鉑類及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2、ATP7A和ATP7B含量增多[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3與外泌體數(shù)量有關(guān)，鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞膜聯(lián)蛋白 A3表達(dá)增多，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多囊泡體形成，繼而促進(jìn)外泌體形成，將鉑類藥物轉(zhuǎn)出細(xì)胞[7]。外泌體不僅參與卵巢癌細(xì)胞對鉑類耐藥，也參與對紫杉醇耐藥。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞通過外泌體將miR-21轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞并直接結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor-1，APAF1)，由于APAF1賦予卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇敏感，因此APAF1失活導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥[20]。

卵巢癌外泌體在促進(jìn)腫瘤血管生成方面的研究不多。有蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了一些潛在涉及卵巢漿液性癌血管生成的外泌體蛋白質(zhì)ATF2、MTA1、ROCK1/2[21]。

四、外泌體作為卵巢癌潛在的新腫瘤標(biāo)志物

目前卵巢癌的診斷仍然依靠腹痛、腹腔積液、腹脹等癥狀，聯(lián)合血清CA125及影像學(xué)檢查。CA125對于卵巢癌來說特異性和敏感度均欠佳，僅50%的FIGO分期Ⅰ期的卵巢癌患者出現(xiàn)CA125升高。因此更特異和敏感的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物亟待被發(fā)掘。

外泌體microRNA作為卵巢癌腫瘤標(biāo)志物有其獨(dú)特的優(yōu)勢：①外泌體microRNA較CA125特異性強(qiáng)；②腫瘤細(xì)胞分泌外泌體量大，外泌體攜帶microRNA量大；③外泌體存在于各種體液中，獲得檢測樣本容易；④外泌體microRNA穩(wěn)定性好，因有囊泡包裹可有效預(yù)防其被降解；⑤可用于卵巢癌的分期、診斷，提示卵巢癌的轉(zhuǎn)移、耐藥及評估預(yù)后，用途多樣。自2008年Taylor等[9]首次提出通過檢測血漿中外泌體microRNA來診斷卵巢癌，越來越多的外泌體microRNA作為卵巢癌潛在的新腫瘤標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)(表1)。

表1 外泌體microRNA作為卵巢癌腫瘤標(biāo)志物

卵巢癌外泌體內(nèi)存在一些特異性蛋白質(zhì)，并在卵巢癌早期、晚期及化療前后含量發(fā)生變化，因此這些特異性蛋白質(zhì)也可能成為潛在的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物。已報(bào)道可診斷和(或)提示預(yù)后的外泌體蛋白質(zhì)為EpCAM、CD24以及CD24聯(lián)合EpCAM、活化白細(xì)胞黏附分子、核仁磷酸蛋白、組織蛋白酶D、p53、SSX共同抗原、緊密連接蛋白claudin-4等[18, 27～30]。可提示卵巢癌期別早晚的外泌體蛋白質(zhì)有胎盤堿性磷酸酶、TAG 72、存活蛋白、NY-ESO-1、GRP78和Muc16[29]。反映化療效果者為膜聯(lián)蛋白A3、EpCAM聯(lián)合CD24[7,31]。

外泌體作為卵巢癌細(xì)胞持續(xù)釋放的信號，很可能較異常升高的血清CA125異常更早被檢測到。卵巢癌患者如能早期診斷并規(guī)范治療，預(yù)后將會明顯改善。哪種外泌體miRNA和(或)蛋白質(zhì)是卵巢癌的最佳腫瘤標(biāo)志物尚待篩選比較，且目前研究多針對上皮性卵巢癌，外泌體作為其他病理類型卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物在未來的研究中也應(yīng)考慮。

五、外泌體在卵巢癌治療中的應(yīng)用

鑒于外泌體廣泛參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，因此，也可多途徑應(yīng)用于卵巢癌治療。目前已經(jīng)證實(shí)有效的途徑為減少外泌體數(shù)量、外泌體介導(dǎo)免疫治療、外泌體作為藥物載體。

Marleau等[32]提出一種可以嵌合到血液透析機(jī)的親和平臺裝置，可通過該裝置過濾和清除外泌體作為癌癥治療的輔助方法。也有研究提出可使用阿米洛利以減少外泌體形成[33]。

多項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)證實(shí)外泌體在惡性黑色素瘤、晚期非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌免疫治療中的安全性和有效性[34]。眾多研究正在逐步揭卵巢癌外泌體參與的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對其全面、透徹的認(rèn)識有助于阻止卵巢癌細(xì)胞免疫逃逸和增強(qiáng)卵巢癌患者抗腫瘤免疫反應(yīng)。外泌體在卵巢癌免疫治療方面的臨床試驗(yàn)尚為空白，但外泌體在其他惡性腫瘤免疫治療的成功經(jīng)驗(yàn)可以借鑒。

有研究者比喻外泌體為“公交車”，恰好可以利用外泌體的載體角色攜帶藥物以治療疾病，其優(yōu)勢在于無細(xì)胞毒性、低免疫原性、能穿越生物屏障、保持藥物生物活性狀態(tài)、靶向作用于器官/細(xì)胞。以外泌體作為阿霉素或紫杉醇載體的動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，外泌體能夠?qū)⒒熕幬镞\(yùn)送至腫瘤并抑制腫瘤生長且未觀察到不良反應(yīng)[35,36]。此外，還有實(shí)驗(yàn)向外泌體導(dǎo)入外源性小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)作為其負(fù)載藥物以治療腫瘤，這在宮頸癌治療中顯示是有效的。有研究者將靶向沉默RAD51的外源性siRNA導(dǎo)入宮頸癌HeLa細(xì)胞來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)它能夠有效抑制受體腫瘤細(xì)胞RAD51的基因表達(dá)，并引起腫瘤細(xì)胞大量死亡。

六、展 望

外泌體攜帶其來源細(xì)胞大量的生物學(xué)信息、廣泛參與各種生理病理過程，現(xiàn)已探知的或是冰山一角，更深度的蛋白質(zhì)、RNA測序還需繼續(xù)，其與腫瘤微環(huán)境的相互作用機(jī)制也需進(jìn)一步明確。便捷高效且經(jīng)濟(jì)的提取高純度外泌體的技術(shù)方法仍待發(fā)現(xiàn)，這限制了其應(yīng)用于臨床中?，F(xiàn)已篩選出一些外泌體所攜帶的生物活性物質(zhì)作為卵巢癌潛在腫瘤標(biāo)志物，但還有大量工作需要完善，一方面需要確定這些生物活性物質(zhì)中哪種為最佳選項(xiàng)，另一方面還需要與傳統(tǒng)的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125進(jìn)行對比，這不妨礙外泌體成為極具前景的卵巢癌新型腫瘤標(biāo)志物，以期早期診斷卵巢癌。鑒于外泌體在其他腫瘤治療的成功經(jīng)驗(yàn)，將外泌體應(yīng)用于卵巢癌的治療是可行的，但需基于前述問題的解決，或能帶來較目前已有藥物更好的治療效果。