曹菲，李永泉，毛旭明

（1浙江大學(xué)藥物生物技術(shù)研究所，浙江杭州310058；2浙江省微生物生化與代謝工程重點實驗室，浙江杭州310058）

環(huán)氧水解酶（epoxide hydrolases，EHs）是一類非常重要的生物催化劑，能選擇性水解外消旋環(huán)氧化物生成具有高度手性選擇性的環(huán)氧化物和鄰二醇［1-3］，在制藥工程、生物工程、化學(xué)工程等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。微生物來源的EHs大多屬于α/β折疊酶［4］，相比于動植物來源的EHs，它的優(yōu)點是容易大量制備、催化效率高且立體選擇性強［5-6］，同時催化反應(yīng)不需要輔酶的參與［6-7］。因此，微生物來源的EHs在生物催化領(lǐng)域被視為一類非常有價值的生物催化劑［8-10］。

近10年來，隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展，又有許多微生物EHs通過基因組挖掘被發(fā)現(xiàn)［11-28］。同時越來越多需要EHs參與的復(fù)雜天然產(chǎn)物合成途徑被解析［29-41］。還有部分病原微生物中也發(fā)現(xiàn)了新的EHs，這些EHs參與微生物生長代謝，可以作為藥物靶點［42-49］。這些新發(fā)現(xiàn)的微生物EHs在手性化合物合成中具有潛在的應(yīng)用價值。與此同時，研究者也對EHs的酶學(xué)特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與催化機理進行了深入的研究。

21世紀(jì)以來，合成生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展十分迅速，EHs作為一類重要的工程酶同時也是一類強有力的合成元件。許多研究者改變了手性藥物中間體的合成思路，從簡單的單酶催化到將合成元件（含EHs）流水線式組裝入微生物細胞工廠，從頭合成或從中間體通過一系列反應(yīng)最終得到產(chǎn)物［50-51］。運用合成生物學(xué)理念，改變EHs應(yīng)用方法，有利于降低底物成本、提高酶利用率，從而進一步降低手性藥物中間體生產(chǎn)成本。本文作者介紹了微生物來源的EHs催化機制，總結(jié)了近10年來發(fā)現(xiàn)的新型微生物來源的EHs，還介紹了目前EHs在生物催化和合成生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的進展。

1 微生物來源的環(huán)氧水解酶

1.1 酶學(xué)特性

微生物來源的EHs能不對稱水解外消旋環(huán)氧化物生成有價值的手性化合物，具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，已經(jīng)成為手性藥物中間體合成領(lǐng)域重要的生物催化劑。EHs的催化效率高［5］，底物區(qū)域與立體選擇性高［6］，反應(yīng)不需輔酶或輔基參與，同時產(chǎn)物的手性控制強［6-7］。來源于放射形土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium radiobacterAD1）的EH（ArEH）研究得比較透徹。1997年，Rink等［52］報道A.radiobacterAD1能在以環(huán)氧氯丙烷為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，原因是體內(nèi)的ArEH能將環(huán)氧氯丙烷水解為3-氯-1，2-丙二醇，然后通過鹵代醇脫鹵酶將其轉(zhuǎn)化為縮水甘油，縮水甘油進一步被中心代謝轉(zhuǎn)化為甘油。研究者通過克隆ArEH基因，在Escherichia coliBL21（DE3）中大量表達與純化，測定了ArEH的酶學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)：①ArEH底物選擇性高，底物譜分析表明環(huán)氧氯丙烷和環(huán)氧溴丙烷是最好的底物；②ArEH催化速率高，ArEH與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)的Km遠小于50 mmol/L，vmax約為38 U/mg蛋白，催化常數(shù)kcat值約為21 s-1。

1.2 EHs催化機理

大部分微生物EHs屬于α/β折疊水解酶家族，因其含有的核心結(jié)構(gòu)域和帽子結(jié)構(gòu)域兩個功能性的結(jié)構(gòu)單元都由α螺旋和β折疊組成［53］，活性位點位于核心和帽子結(jié)構(gòu)域之間的主要疏水環(huán)境中。ArEH是具代表性的、研究比較透徹的一種α/β折疊型EH。以ArEH為代表的EHs活性位點由催化三聯(lián)體殘基構(gòu)成，包括活性結(jié)構(gòu)域中的親核殘基Asp、His和羧酸殘基Asp/Glu；帽子結(jié)構(gòu)域中Tyr為反應(yīng)提供質(zhì)子?，F(xiàn)在比較公認的EHs催化的反應(yīng)歷程是通過兩步法進行的。例如，ArEH的催化反應(yīng)機理為：①Asp107親核攻擊環(huán)氧化物上的碳原子將環(huán)打開，形成共價酯中間體，Tyr152提供質(zhì)子形成醇；②Asp246輔助His275活化水分子，使酯中間體水解形成鄰二醇，并使產(chǎn)物與酶分離［54-55］。

也有一些EHs與上述ArEH有不同的結(jié)構(gòu)與催化機制，例如紅平紅球菌Rhodococcus erythropolisDCL14來源的檸檬烯1，2-環(huán)氧水解酶（limonene-1，2-epoxide hydrolase，LEH）。LEH類EHs與α/β折疊型EHs區(qū)別是：LEH分子量較小，不具備α/β折疊結(jié)構(gòu)，由α螺旋和β折疊彎曲形成疏水口袋。LEH活性位點由Arg99、Asp101和Asp132構(gòu)成，其催化反應(yīng)機理為：①Arg99分別與Asp131、Asp246的羧基形成氫鍵，穩(wěn)定電荷，Tyr53、Asn55和Asp132與水分子形成氫鍵，將水分子定位于有利于親核攻擊底物的氧環(huán)；②Asp101為環(huán)氧化物的氧提供質(zhì)子形成醇，Asp132吸引水分子中的質(zhì)子，輔助親核攻擊環(huán)氧化物環(huán)碳原子直接形成二醇，而不形成酯中間體［56-57］。不同菌種來源的EHs基本都與上述兩類EHs具有相似性，目前尚未有文章報道有新類型的微生物EHs。

1.3 微生物來源的新型EHs

近10年來，隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷地有新微生物EHs被發(fā)現(xiàn)（表1）。2010—2019年，至少在30余種微生物中發(fā)現(xiàn)了新的能催化不同底物的EHs，并且至少有15個微生物EHs已經(jīng)完成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析。表1中總結(jié)了近10年報道的新發(fā)現(xiàn)的EHs或具備EH活性的菌株，羅列了EHs能催化的底物以及生成的產(chǎn)物。通過總結(jié)EHs來源菌株發(fā)現(xiàn)，挖掘新型微生物EHs的主要方法有：①篩選能催化生成手性環(huán)氧化物或二醇的菌株，并進一步鑒定相應(yīng)的EHs（表1編號1～19）；②表征微生物天然產(chǎn)物的合成途徑中的后修飾酶（表1編號20～34）；③分析鑒定能引起人或動物疾病的病原微生物體內(nèi)的藥物靶標(biāo)。此外，這些EHs催化的底物既包含結(jié)構(gòu)簡單的環(huán)氧化物，也包含結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，說明微生物EHs具有寬泛的底物譜。這些新發(fā)現(xiàn)的EHs在手性藥物中間體、復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中具備很好的應(yīng)用開發(fā)前景。

表1 2010—2019年微生物中新發(fā)現(xiàn)的EHsTab.1 Newly discovered microbial EHs in 2010—2019

續(xù)表

續(xù)表

2 微生物EHs的應(yīng)用

2.1 基于生物轉(zhuǎn)化的手性藥物中間體合成

手性環(huán)氧化物及鄰二醇制備主要有化學(xué)合成法［58-59］和生物催化法［60-61］?；瘜W(xué)合成手性環(huán)氧化物目前存在著反應(yīng)條件苛刻、選擇性差、重金屬催化劑昂貴、環(huán)境不友好等問題［62］。而微生物來源的EHs制備成本低、酶催化效率高且不需輔酶與輔基參與反應(yīng)［7］。更為重要的是，EHs對對映體選擇性很高，能不對稱水解外消旋環(huán)氧化物制備光學(xué)純的環(huán)氧化物和鄰二醇，生成多種有重要價值的手性藥物中間體［62-63］，例如（R）-環(huán)氧氯丙烷［64-66］、手性苯基乙二醇［67］、（S）-芳基縮水甘油醚等［68-69］。

許多研究者通過對反應(yīng)條件的摸索與優(yōu)化［70］，結(jié)合隨機突變［71-72］、迭代飽和突變［73-74］、定點突變等［75-77］酶的定向進化技術(shù)，對不同來源的微生物EHs加以優(yōu)化改造提升催化活性、對映選擇性以及產(chǎn) 物 產(chǎn) 率 等 性 質(zhì)。Saini等［70］從Streptomyces griseusNBRC 13350基因組中發(fā)現(xiàn)了一種新的EH，該EH能將消旋苯基縮水甘油醚（PGE）動力學(xué)分解為（R）-PGE。通過催化條件摸索與優(yōu)化，當(dāng)反應(yīng)中細胞與底物比20：1（質(zhì)量比）、pH 7.5、20℃、體系含10%二甲基甲酰胺（體積分數(shù)）時，（R）-PGE產(chǎn)率為34%，e.e.達到99%。

按照隨機突變策略，Jin等［78］使用60Coγ射線和紫外線照射誘變EH生產(chǎn)菌株Aspergillus nigerZJB-09103，篩選到了陽性突變菌株的EH，其活性達到33.7 U/g，是野生型菌株EH活性的2.7倍。突變株催化生成（S）-環(huán)氧氯丙烷所需的反應(yīng)時間縮短了2.5倍，e.e.達到99%，收率約為17.6%。運用酶的定向進化技術(shù)，Zou等［73］通過迭代飽和突變ArEH，發(fā)現(xiàn)T247K/I108L/D131S突變的ArEH與野生型酶相比，對環(huán)氧氯丙烷的催化效率提高了4.5倍，對環(huán)氧氯丙烷的對映體選擇性提高了2.1倍，50℃條件下熱穩(wěn)定性提高了8倍。使用突變的ArEH對外消旋環(huán)氧氯丙烷進行動力學(xué)拆分，（R）-環(huán)氧氯丙烷收率為40.2%，且e.e.大于99.9%，生產(chǎn)率達到1410 g/（L·d）。

2.2 基于合成生物學(xué)理念的新型手性化合物合成方法

微生物來源的EHs不僅在手性藥物中間體有重要的應(yīng)用，隨著近年來合成生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，EHs作為一個重要的合成元件，未來在微生物底盤細胞中重構(gòu)化合物合成途徑［51，79-80］、基因簇異源表達、天然產(chǎn)物組合生物合成［81-82］等方面展現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用潛力。目前，以微生物EHs為合成元件組裝化合物的生物合成途徑，已經(jīng)在以大腸桿菌為代表的原核底盤細胞［80］和以酵母菌為代表的真核底盤細胞中有了較好的應(yīng)用［51］。

大腸桿菌蛋白表達量高，遺傳操作簡便。許多研究者以大腸桿菌為底盤，將EHs與其他催化元件進行串聯(lián)，從而合成手性藥物中間體。Yu等［80］設(shè)計了一套不對稱催化串聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)路線為過氧化酶OleTJE將底物苯丙酸脫羧氧化為苯乙烯，單加氧酶P450-BM3將苯乙烯氧化成（R）-氧化苯乙烯，最后通過Aspergillus niger來源的水解酶ANEH將氧化苯乙烯開環(huán)水解生成R型苯乙二醇類產(chǎn)物。該串聯(lián)反應(yīng)可對至少9種底物實現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性。此外，Sun等［50］設(shè)計了一種新的三步一鍋法級聯(lián)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用環(huán)氧水解酶、甘油脫氫酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶，將外消旋苯乙烯氧化物不對稱合成（R）-苯基甘氨醇。還構(gòu)建了AlaDH/L-Ala的輔助因子自給系統(tǒng)用于再生昂貴的輔助因子NAD+和去除副產(chǎn)物丙酮酸，并用陽離子樹脂吸附去除產(chǎn)物使反應(yīng)的熱力學(xué)平衡朝產(chǎn)物生成的方向發(fā)展。最終，由外消旋苯乙烯氧化物成功制備光學(xué)純的（R）-苯基甘氨醇，產(chǎn)率高達81.9%，e.e.達99%。Liu等［83］開發(fā)了從（S）-環(huán)氧化物一步合成光學(xué)純的1，2-氨基醇的方法。該研究設(shè)計了一種非天然生物催化級聯(lián)反應(yīng)，通過偶聯(lián)環(huán)氧水解酶SpEH、酒精脫氫酶MnADH和ω-轉(zhuǎn)氨酶PAKω-TA，將級聯(lián)反應(yīng)路線構(gòu)建在大腸桿菌BL21（SGMP）體內(nèi)。另外，研究者通過過表達谷氨酸脫氫酶GluDH使得細胞可以同時釋放輔助因子和氨基供體，建立了胞內(nèi)輔因子和供體自足系統(tǒng)。該工程菌SGMP催化的產(chǎn)物e.e.大于99%，從（S）-環(huán)氧苯乙烷到1，2-氨基醇的轉(zhuǎn)化率為99.6%；另外4種（S）-環(huán)氧化物轉(zhuǎn)換為1，2-氨基醇的轉(zhuǎn)化率在65%～96.4%。

除了上述以大腸桿菌為底盤設(shè)計串聯(lián)反應(yīng)外，Yuan等［51］首次嘗試在真核生物釀酒酵母體內(nèi)建立以苯乙烯為中間體生產(chǎn)苯乙二醇的人工生物合成途徑。該研究使用苯丙氨酸氨裂合酶PAL和阿魏酸脫羧酶FDC將苯丙氨酸脫氨基/脫羧生成苯乙烯；對苯乙烯進行（S）-選擇性環(huán)氧化，得到（S）-苯乙烯；再用苯乙烯單加氧酶SMO催化氧化生成（S）-環(huán)氧乙烷；最后，用鞘氨醇單胞菌HXN-200或馬鈴薯的環(huán)氧水解酶SpEH/StEH對（S）-環(huán)氧乙烷進行區(qū)域選擇性水解，生成（S）-苯基乙二醇或（R）-苯基乙二醇。該研究證明，包含立體特異性環(huán)氧水解的級聯(lián)反應(yīng)可以在真核宿主釀酒酵母中功能性表達。小型搖瓶研究表明，經(jīng)過工程改造的酵母細胞工廠在培養(yǎng)96 h后，可生產(chǎn)約100～120 mg/L的（S）-苯基乙二醇或（R）-苯基乙二醇。

3 展望

21世紀(jì)以來，基因組學(xué)的飛速發(fā)展使人們獲取了大量微生物基因組信息，而其中蘊藏著大量具有環(huán)氧水解功能的催化酶基因。經(jīng)過20年左右的努力，隨著生物信息學(xué)、分子遺傳學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，已有數(shù)個EHs被發(fā)掘并成熟應(yīng)用于不對稱催化領(lǐng)域。當(dāng)前，利用微生物EHs生物催化合成手性藥物中間體已經(jīng)成為了一種主流的工業(yè)生產(chǎn)方法。從龐大的微生物基因組中挖掘新型EHs的工作始終在進行中，天然產(chǎn)物生物合成研究構(gòu)筑了EHs應(yīng)用于合成生物學(xué)的堅實基礎(chǔ)。值得注意的是，近年來又有許多新穎的微生物EHs從天然產(chǎn)物生物合成途徑中被鑒定出來。在生物合成中，EHs往往作為一種重要的后修飾酶，介導(dǎo)環(huán)氧底物的開環(huán)反應(yīng)，開環(huán)后的產(chǎn)物還可以被其他后修飾酶進一步催化，從而得到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物。因此，EHs為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性提供了豐富前體。此外，EHs介導(dǎo)的反應(yīng)常常具有高度的區(qū)域、立體選擇性，這相比于化學(xué)合成具有很大的優(yōu)勢，十分具有成為生物催化劑或合成生物學(xué)元件的潛力。因此，在未來從微生物天然產(chǎn)物生物合成途徑中挖掘EHs仍然是一項非常具有開創(chuàng)性的工作，這幫助人們不斷充實EHs的底物譜、擴充備選的EHs生物催化及合成生物學(xué)元件庫。

EHs結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究幫助研究者更加清晰地了解了EHs的催化機制，尤其是其獨特的手性選擇性，這為未來酶的定向改造與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了堅實的理論基礎(chǔ)。目前，許多微生物EHs生物大分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，幾個代表性的EHs催化機理已經(jīng)研究得比較清楚，例如ArEH、LEH等。然而，新穎的微生物EHs數(shù)量仍在不斷增加，其中有不少EHs具備特殊的結(jié)構(gòu)與功能，識別獨特而復(fù)雜的底物。作為一項基礎(chǔ)性研究工作，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析新型微生物EHs結(jié)構(gòu)仍需要研究者們不斷地投入大量的工作。為了將EHs進行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，必須通過不斷提高EHs催化效率、穩(wěn)定性和對映體產(chǎn)物純度等酶學(xué)特性來降低生產(chǎn)成本。研究者基于酶的定向進化策略，通過反應(yīng)體系優(yōu)化、隨機突變、定點突變、迭代飽和突變等技術(shù)，得到了眾多具有優(yōu)良活性的工程酶。這項工作是EHs走上產(chǎn)業(yè)化之路必不可少的環(huán)節(jié)。

21世紀(jì)新興的合成生物學(xué)研究給傳統(tǒng)的基于生物催化生產(chǎn)手性藥物中間體的生產(chǎn)方式帶來了沖擊。其理念是將不同來源的生物合成相關(guān)的代謝途徑模塊化、元件化，并在底盤細胞上組裝；人工設(shè)計目的產(chǎn)物的生物合成途徑，提高代謝途徑的效率，從而實現(xiàn)手性藥物中間體的高效生物合成和規(guī)?；a(chǎn)?；诤铣缮飳W(xué)理念，已有研究將EHs作為合成元件與上游和下游催化元件串聯(lián)組裝入細胞工廠（大腸桿菌、酵母等），組成一條相對完整的代謝通路，用于高效合成手性藥物中間體。未來，催化元件性能的不斷提升、底盤細胞內(nèi)供給系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，將會進一步提升產(chǎn)物生成效率，手性藥物中間體生產(chǎn)成本會逐步降低。這可能會使合成生物學(xué)生產(chǎn)方法逐漸取代單酶催化法，成為手性藥物中間體生產(chǎn)的主流方法。