劉如欣，杜磊，2，徐曉慶，丁金鵬，張偉，李盛英

（1山東大學(xué)微生物技術(shù)研究院，山東青島266237；2山東省合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東青島266101；3乳山韓威生物科技有限公司，山東乳山264502）

1965年Suzuki等［1］首次從分離自日本熊本縣阿蘇地區(qū)土壤的可可鏈霉菌阿蘇變種（Streptomyces cacaoivar.asoeinsis）的發(fā)酵液中檢測(cè)到一種具有較強(qiáng)抗真菌活性的肽基核苷類抗生素，由于該抗生素的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氧原子，將其命名為多氧霉素。1967年我國(guó)中國(guó)科學(xué)院微生物所在安徽省合肥市的菜園土壤中分離到另一株多氧霉素的產(chǎn)生菌金色鏈霉菌（S.aureochromogenes）［2］。多氧霉素對(duì)多種真菌引起的農(nóng)作物病害如黑斑病、灰霉病等具有很好的防治效果，且對(duì)動(dòng)植物沒(méi)有毒性，在環(huán)境中可降解，是一種理想的綠色農(nóng)藥。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的應(yīng)用，目前多氧霉素仍然是在全球應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)用抗生素之一。

多氧霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase）的底物尿苷二磷酸酯-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-Glc NAc）相似，因而能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞因滲透壓差異而裂解［3-4］。Isono等［3，5-7］將可可鏈霉菌阿蘇變種的發(fā)酵液進(jìn)行多步分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)多氧霉素由多氧霉素A～M 13個(gè)組分組成（圖1），其中A和B為主要組分，B組分的抗真菌效果尤為顯著。之后Uramoto等［8］又從S.piomogenus分離得到新組分多氧霉素N，與其他多氧霉素不同，多氧霉素N是一種雜合抗生素，它由多氧霉素的肽基和尼可霉素的核苷骨架組合而成（圖1）。

圖1 多氧霉素的結(jié)構(gòu)與組成［6］Fig.1 Composition and structures of polyoxins[6]

多氧霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要由核苷骨架（nucleoside skeleton）、氨 甲 酰 多 聚 草 氨 酸（carbamoylpolyoxamic acid，CPOAA）和聚肟酸（polyoximic acid，POIA）三部分組成［9］，其中核苷骨架以尿苷和磷酸烯醇式丙酮酸為前體［10］，氨甲酰多聚草氨酸的合成前體為異亮氨酸［11-12］，聚肟酸合成前體為谷氨酸。2009年Chen等［13］首次從S.cacaoi基因組文庫(kù)中克隆到多氧霉素的完整生物合成基因簇，并成功在S.lividansTK24中進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了多氧霉素H組分的產(chǎn)生。多氧霉素基因簇含有20個(gè)基因：polB、polA、polD、polH、polI、polJ和polK七個(gè)基因負(fù)責(zé)核苷骨架的合成［10］，肽基CPOAA由polL、polM、polN、polO和polP五個(gè)基因負(fù)責(zé)組裝［14］，polC、polE和polF則負(fù)責(zé)另一個(gè)肽基POIA的合成［13］，最后由polG基因編碼的PolG蛋白負(fù)責(zé)將兩個(gè)肽基組裝到核苷骨架上，polQ1與polQ2編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，polR［15］和polY［16］為正調(diào)控基因。

物理或化學(xué)誘變育種是傳統(tǒng)的抗生素菌種選育方法，具有速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)在于缺乏定向性，必須與大規(guī)模篩選相配合才能獲得較好的效果。近年來(lái)，隨著分子育種及合成生物學(xué)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的策略，如增加目標(biāo)產(chǎn)物合成基因簇的拷貝數(shù)、提高前體供應(yīng)、阻斷競(jìng)爭(zhēng)通路、重整目標(biāo)產(chǎn)物基因簇等［17］。其中，增加基因簇的拷貝數(shù)可顯著提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量：Yanai等［18］通過(guò)在卡那霉素鏈霉菌中將卡那霉素基因簇的拷貝數(shù)增加2，使卡那霉素的產(chǎn)量翻番。該課題組［19-20］隨后又發(fā)現(xiàn)了由ZouA和RsA/RsB介導(dǎo)的基因倍增系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)使放線紫紅素的產(chǎn)量提高了20多倍。蘆銀華等［21］利用其建立的多重整合酶-多重attB位點(diǎn)的方法將5-氧代米爾貝霉素的基因簇增加了3個(gè)拷貝，使其產(chǎn)量提高了近2倍。ExoCET直接克隆技術(shù)將核酸外切酶介導(dǎo)的體外同源重組和RecET介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)同源重組有效結(jié)合，可以快速、高效地對(duì)大片段DNA（如次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇）進(jìn)行直接克隆，可有效用于基因簇倍增［22-25］。例如：Ongley等［26］利用直接克隆技術(shù)成功從不可培養(yǎng)的海洋藻青菌中克隆了lyngbyatoxin的生物合成基因簇，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，其產(chǎn)量為25.6 mg/L，其前體化合物indolactamV的產(chǎn)量達(dá)到了150 mg/L；Bian等［27］利用直接克隆技術(shù)成功從伯克菌DSM7029中克隆了一種蛋白酶抑制劑——glidobactin的生物合成基因簇，并通過(guò)在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)將其產(chǎn)量提高了10倍。

我國(guó)于20世紀(jì)70年代開(kāi)始進(jìn)行有關(guān)多氧霉素菌種選育和生產(chǎn)工藝的研究，但是其生產(chǎn)水平仍然較低、成本較高，目前主要依賴于從日本進(jìn)口的含多氧霉素的農(nóng)藥品種寶麗安［2］。本文作者為了提高多氧霉素B的產(chǎn)量，從一株由本實(shí)驗(yàn)室自土壤環(huán)境中分離得到的多氧霉素產(chǎn)生菌——金色鏈霉菌出發(fā)，將傳統(tǒng)的紫外誘變育種與基因工程育種相結(jié)合，首先通過(guò)紫外誘變育種初步篩選多氧霉素B高產(chǎn)菌株，然后通過(guò)ExoCET直接克隆技術(shù)將多氧霉素生物合成基因簇pol克隆到p15A載體上，并利用Red/ET重組工程技術(shù)對(duì)得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行修飾，進(jìn)而構(gòu)建pol倍增菌株，成功提高了工程菌多氧霉素B的產(chǎn)量，期待為我國(guó)多氧霉素的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供候選菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和引物

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。寡核苷酸引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本研究所用的寡核苷酸序列見(jiàn)表2。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉0.1 g。

MS培養(yǎng)基（100 mL）：大豆粉2 g，甘露醇2 g，瓊脂2 g。

表2 本研究所用的寡核苷酸序列Tab.2 Nucleotide sequences used in this study

孢子斜面培養(yǎng)基（100 mL）：可溶性淀粉2 g，KNO30.1 g，K2HPO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaCl 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，瓊 脂2 g，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（100 mL）：酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨1.6 g，KNO30.1 g，K2HPO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaCl 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：淀粉5 g，豆粕粉2.5 g，酵母提取物0.5 g，甘露醇0.5 g，NaCl 0.5 g，（NH4）2SO40.05 g，CaCO30.2 g，pH 7.1。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：限制性DNA內(nèi)切酶購(gòu)自莫納生物科技有限公司和New England BioLabs公司；T4 DNA聚合酶購(gòu)自New England BioLabs公司；PrimeSTAR Max DNA聚 合 酶、DNA Marker購(gòu) 自Takara公 司；RNase A購(gòu) 自O(shè)mega Bio-Tek公 司；蛋白胨、酵母粉等購(gòu)自O(shè)xoid公司；瓊脂粉、瓊脂糖、50×TAE電泳緩沖液、10×TBE電泳緩沖液購(gòu)自Solarbio公司；Buffer P1、P2、P3、DNA純化回收試劑盒等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

儀器：賽百奧紫外誘變箱；Bruker液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀；萊玻特瑞恒溫恒濕培養(yǎng)箱；Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀；Thermofisher Nanodrop微量紫外分光光度計(jì)；Tanon凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 紫外誘變初步篩選多氧霉素高產(chǎn)菌株

1.2.1 紫外誘變

將鏈霉菌孢子懸液稀釋至107mL-1，取3 mL混勻的單孢子懸液置于無(wú)菌平板上，分別以不同時(shí)間（5 s、10 s、20 s、40 s、60 s）的紫外照射時(shí)間為紫外線處理劑量，放置于已預(yù)熱20 min的紫外誘變箱（波長(zhǎng)253.5 nm，強(qiáng)度30 W，距離30 cm）中進(jìn)行誘變。紫外線誘變處理后，為防止可見(jiàn)光下回復(fù)突變，用黑紙包裹平板，避光靜置2 h。取出后在紅光下進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-5），再分別以從低到高濃度的順序涂布于斜面培養(yǎng)基平板中，28℃暗處培養(yǎng)4～7 d。同時(shí)，未經(jīng)紫外處理的孢子進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，作為對(duì)照。

致死率的計(jì)算方法：

通過(guò)計(jì)算紫外誘變致死率，確定最佳的紫外誘變參數(shù)。挑取100株突變后的單菌落，傳代一次制備孢子懸液備用。

1.2.2 多氧霉素突變株的發(fā)酵和產(chǎn)量檢測(cè)

接種不同突變株的孢子于孢子斜面培養(yǎng)基，于29℃培養(yǎng)7 d，可見(jiàn)明顯黑色孢子生成。接種0.5 cm2到25 mL種子培養(yǎng)基（250 mL三角燒瓶），250 r/min，29℃，培養(yǎng)1 d，可見(jiàn)形成大量細(xì)顆粒的菌絲體。按10%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基（25 mL/250 mL），250 r/min，29℃，培養(yǎng)6 d，到衰亡期停止發(fā)酵，培養(yǎng)過(guò)程嚴(yán)格控制溫度不高于30℃。收集發(fā)酵液，離心去除菌體，吸取1 mL上清，加入200μL甲醇，振蕩1 min，最高轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為YMC-Triart C18，4.6 mm×250 mm，5μm；流動(dòng)相，A相為水+0.1%甲酸，B相為乙腈+0.1%甲酸；洗脫程序?yàn)?～10 min 100%A，10～15 min 93%A，15.5～23 min 0%A，23～23.5 min 100%A，23.5～28 min 100%A；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm；進(jìn)樣體積20μL。

標(biāo)準(zhǔn)品制備：用50%多氧霉素B粉末作為標(biāo)準(zhǔn)品，稱取2 mg，加800μL水溶解，加200μL甲醇，充分振蕩，最高轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.3 多氧霉素基因簇的直接克隆

1.3.1S.ansochromogenesPol-12基因組的提取

將50 mL培養(yǎng)2 d的鏈霉菌菌液8300g離心5 min，棄上清。用30 mL無(wú)菌ddH2O重懸菌體，渦旋混勻8300g離心5 min，棄上清。用8 mL SET溶液重懸細(xì)胞，渦旋混勻。加入10 mg溶菌酶，顛倒混勻，37℃水浴1 h，間斷顛倒。加入500μL 20mg/mL的Proteinase K，顛倒混勻，加入1 mL 10%SDS，顛倒混勻。50℃水浴2 h，中間間斷顛倒，直至溶液澄清。加入3.5 mL 5 mol/L NaCl，顛倒混勻。加入15 mL苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，至呈乳濁狀。8300g離心30 min。用去尖槍頭取上清500μL分裝至2 mL EP管。加入35μL 3 mol/L NaAc和1.2 mL無(wú)水乙醇，顛倒混勻。準(zhǔn)備新的2 mL EP管，加入1.5 mL 70%乙醇，用黃槍頭將絮狀DNA轉(zhuǎn)移至EP管中，9400g離心1 min。棄上清，倒置于吸水紙上，常溫干燥30 min。用500μL ddH2O溶解DNA。

1.3.2S.ansochromogenesPol-12基因組酶切產(chǎn)物制備

選擇合適的限制性內(nèi)切酶BsrDⅠ，酶切基因組，釋放基因簇片段。取濃度為200 ng/μL的基因組DNA 250μL，加入40μL 10×Cutsmart、15μL限制性內(nèi)切酶BsrDI、2μL RNase A，用雙蒸水補(bǔ)至400μL，37℃反應(yīng)4 h。取10μL酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)之后用對(duì)苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）抽提酶切產(chǎn)物除去蛋白，然后進(jìn)行酒精沉淀。

1.3.3 直接克隆載體的制備

以p15Acm-PO-1和p15Acm-PO-2為PCR引物，以質(zhì)粒p15A-cm-tetR-tetO-hyg-ccdB為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小為2720 bp的PCR產(chǎn)物p15A-cm-PO PCR，切膠回收目的片段。

1.3.4 多氧霉素基因簇的直接克隆

直接克隆載體和酶切基因組產(chǎn)物在體外用T4 DNA Polymerase退火：取200 ng p15A-cm-PO PCR，加入2μg基因組酶切產(chǎn)物、0.2μL 10×NEB Buffer 2.1、0.13μL T4 DNA Polymerase、12.87μL雙 蒸 水，PCR儀 中25℃1 h，75℃20 min，50℃30 min，1個(gè)循環(huán)，4℃保溫。反應(yīng)完成之后將產(chǎn)物室溫除鹽30 min。將上述除鹽后的產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到經(jīng)L-Ara誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞E.coliGB05dir（含有pSC101-BAD-ETgA）中。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析。

1.4 多氧霉素基因簇倍增菌株的構(gòu)建

1.4.1 質(zhì)粒p15A-apra-oriT-phiC31的構(gòu)建

制備質(zhì)粒p15A-cm-tetR-tetO-hyg-ccdB和pR6K-oriT-phiC31，用限制性內(nèi)切酶AseⅠ酶切pR6K-oriT-phiC31，得到帶有同源臂的酶切片段apra-oriT-phic31。將酶切產(chǎn)物用Omega Bio-tek DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。將200 ng酶切產(chǎn)物apra-oriT-phic31和200 ng p15A-cm-tetR-tetO-hygccdB共同電轉(zhuǎn)化入經(jīng)L-Ara誘導(dǎo)的GBred-gyrA462中。挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶AseI進(jìn)行酶切鑒定。

1.4.2 p15A-apra-Pori-pol的構(gòu)建

以鏈霉菌S.ansochromogenesPol-12基因組DNA為模板、oripromoter-1/2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到原始啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物ori-promoter PCR；以p15A-apra-oriT-phiC31為模板、p15Aapra-PO-1/2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物p15Aapra-PO PCR-1。以ori-promoter PCR和p15Aapra-PO PCR-1為模板，以p15Aapra-PO-3和oripromoter-1進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，得到p15Aapra-PoriPCR。制備質(zhì)粒p15A-cm-pol，將500 ng p15A-apra-PoriPCR和500 ng p15A-cm-pol共同電轉(zhuǎn)化入經(jīng)L-Ara誘導(dǎo)的GBred的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，小量提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒p15A-apra-Pori-pol送生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)同源臂部分進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

1.4.3 p15A-apra-PkasOp*-pol的構(gòu)建

以p15A-apra-oriT-phiC31為模板，以p15Aapra-PO-1和p15Aapra-kasOp*-PO-2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物p15A-apra-PkasOp*PCR。將500 ng p15A-apra-PkasOp*PCR和500 ng p15A-cm-pol共同電轉(zhuǎn)化入經(jīng)L-Ara誘導(dǎo)的GB05red的感受態(tài)細(xì)胞中，用限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)得到的重組子進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒p15A-apra-PkasOp*-pol送去生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)同源臂部分進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4pol在鏈霉菌S.ansochromogenesPol-12中的整合和表達(dá)

將質(zhì)粒p15A-apra-Pori-pol和p15A-apra-PkasOp*-pol分別電轉(zhuǎn)化入E.coliET12567/pUZ8002中。鏈霉菌和大腸桿菌的接合轉(zhuǎn)移參照文獻(xiàn)［28］。多氧霉素的發(fā)酵和產(chǎn)量檢測(cè)方法同1.2.2。

2 結(jié)果和分析

2.1 紫外誘變篩選多氧霉素高產(chǎn)菌株

通過(guò)1.2的公式計(jì)算紫外誘變致死率，確定最佳的紫外誘變參數(shù)為5～10 s（致死率90%～95%）。經(jīng)紫外誘變和100株隨機(jī)挑選的突變菌株的多氧霉素B產(chǎn)量比較，得到突變株S.ansochromogenesPol-12，其搖瓶發(fā)酵6 d的產(chǎn)量較野生型菌株提高了1.2倍。

2.2 多氧霉素基因簇的直接克隆

2.2.1 基因組提取及酶切

按1.3.1的方法制備基因組，并用限制性內(nèi)切酶BsrDⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，釋放多氧霉素基因簇，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組的酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。如圖2所示，未酶切的基因組DNA為單一的條帶，而B(niǎo)srDⅠ酶切后的基因組DNA條帶較多，并且亮度從上到下呈梯度式下降，說(shuō)明得到的酶切產(chǎn)物DNA質(zhì)量較好。

2.2.2 多氧霉素基因簇直接克隆載體的制備

PCR擴(kuò)增的模板為p15A-cm-tetR-tetO-hygccdB，模板上帶有ccdB反向篩選基因，可以消除篩選中由模板帶來(lái)的背景菌落。PCR產(chǎn)物的大小與預(yù)期條帶（2720 bp）的大小一致，切膠回收PCR產(chǎn)物（圖3）。

2.2.3 多氧霉素基因簇的直接克隆

將直接克隆載體和基因組酶切產(chǎn)物的T4 DNA Polymerase退火產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至表達(dá)了RecET的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇涂板后37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取8個(gè)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行酶切鑒定（圖4），所有酶切條帶大小均符合預(yù)期，然后對(duì)酶切條帶正確的質(zhì)粒的同源臂部分進(jìn)行測(cè)序，同源臂序列測(cè)序正確，表明得到了含有pol的重組質(zhì)粒p15A-cm-pol。

2.3 多氧霉素基因簇倍增菌株的構(gòu)建

2.3.1 質(zhì)粒p15A-apra-oriT-phiC31的構(gòu)建

來(lái)源于噬菌體的Red/ET重組酶可以在大腸桿菌中介導(dǎo)一個(gè)線性DNA分子和一個(gè)環(huán)狀DNA分子發(fā)生重組，簡(jiǎn)稱線環(huán)重組（linear-circular homologous recombination，LCHR）。為了方便下一步接合轉(zhuǎn)移和位點(diǎn)特異性元件的插入，將含有篩選標(biāo)記阿泊拉霉素抗性基因apra、轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT、整合酶基因phiC31的片段apra-oriT-phiC31通過(guò)Red/ET重組酶介導(dǎo)的線環(huán)重組替換掉p15A-cmtetR-tetO-hyg-ccdB上的氯霉素抗性基因cm（圖5），獲得質(zhì)粒p15A-apra-oriT-phiC31。通過(guò)酶切鑒定分析6個(gè)轉(zhuǎn)化子的酶切條帶均與預(yù)測(cè)條帶相符，從中選取3個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同源臂部分測(cè)序，得到了1個(gè)同源臂序列正確的重組質(zhì)粒p15A-apra-oriTphiC31。

圖2 鏈霉菌S.ansochromogenes Pol-12的基因組及其限制性內(nèi)切酶BsrDⅠ酶切產(chǎn)物M—Takara DL10 000 DNA Marker；1—S.ansochromogenes Pol-12的基因組DNA；2—S.ansochromogenes Pol-12基因組DNA的BsrDⅠ酶切產(chǎn)物Fig.2 Genomic DNA of S.ansochromogenes Pol-12 and its digestion product by BsrDⅠ

圖3 直接克隆載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification product of direct cloning vector

圖4 多氧霉素基因簇的直接克隆Fig.4 Direct cloning of pol gene cluster

2.3.2 原始啟動(dòng)子、kasOp*啟動(dòng)子以及接合轉(zhuǎn)移和位點(diǎn)特異性整合元件的插入

由于直接克隆得到的重組質(zhì)粒p15A-cm-pol未包含啟動(dòng)子部分，為比較原始啟動(dòng)子和強(qiáng)啟動(dòng)子kasOp*對(duì)多氧霉素產(chǎn)量的影響，分別將原始啟動(dòng)子和kasOp*啟動(dòng)子插入基因簇第1個(gè)基因上游，通過(guò)線環(huán)重組構(gòu)建重組質(zhì)粒p15A-apra-Pori-pol和p15Aapra-PkasOp*-pol（圖6），分別挑取了7個(gè)和15個(gè)轉(zhuǎn)化子，通過(guò)酶切鑒定分析表明分別得到了1個(gè)和2個(gè)與預(yù)測(cè)條帶相符的轉(zhuǎn)化子，并對(duì)酶切鑒定正確的轉(zhuǎn)化子的同源臂部分進(jìn)行測(cè)序，同源臂序列均正確。

2.3.3 多氧霉素基因簇在鏈霉菌S.ansochromogenesPol-12中的整合

通過(guò)phiC31介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組將構(gòu)建的包含多氧霉素基因簇pol的質(zhì)粒整合到S.ansochromogenesPol-12基因組上，構(gòu)建多氧霉素基因簇倍增菌株。從MS篩選平板上挑取接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證（圖7）。

2.4 多氧霉素基因簇倍增菌株的產(chǎn)量檢測(cè)

按照1.2.2節(jié)進(jìn)行菌株發(fā)酵和產(chǎn)量檢測(cè)，多氧霉素基因簇倍增菌株發(fā)酵液進(jìn)行HPLC-MS分析，根據(jù)多氧霉素B的分子量，從基峰圖中提取分子量508，得到如圖8所示的結(jié)果，并對(duì)樣品中多氧霉素B組分的色譜峰進(jìn)行積分計(jì)算峰面積，發(fā)現(xiàn)與S.ansochromogenesPol-12相比，插入了原始啟動(dòng)子調(diào)控下的pol倍增菌株M1（S.ansochromogenesPol-12：：Pori-pol）多氧霉素B的產(chǎn)量提高了22倍，而插入了kasOp*強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控下的pol倍增菌株M2（S.ansochromogenesPol-12：：PkasOp*-pol）多氧霉素B的產(chǎn)量提高了33倍。

圖5 質(zhì)粒p15A-apra-oriT-phiC31的構(gòu)建與鑒定Fig.5 Construction of p15A-apra-oriT-phiC31 and its verification

圖6 原始啟動(dòng)子、kasOp*啟動(dòng)子以及接合轉(zhuǎn)移和位點(diǎn)特異性整合元件的插入與鑒定Fig.6 Insertion of original promoter,kasOp*promoter,and elements for conjunction and site-specific integration as well as their verification

圖7 多氧霉素基因簇整合入S.ansochromogenes Pol-12基因組的PCR驗(yàn)證Fig.7 PCR verification of pol gene cluster integrated into attB site in S.ansochromogenes Pol-12

圖8 倍增菌株中多氧霉素B的產(chǎn)量檢測(cè)Fig.8 Yield dassay of polyoxin B from the pol duplicated strains

3 結(jié)論

雖然多氧霉素已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，但是我國(guó)多氧霉素B的產(chǎn)業(yè)化水平較低、生產(chǎn)成本高，因此有必要開(kāi)展有關(guān)多氧霉素B高產(chǎn)菌株構(gòu)建的研究。

本文將傳統(tǒng)的紫外誘變育種和基因工程育種相結(jié)合，期望提高多氧霉素尤其是B組分的產(chǎn)量。首先通過(guò)紫外誘變初步篩選到了突變株S.ansochromogenesPol-12，然后通過(guò)ExoCET直接克隆技術(shù)成功將多氧霉素生物合成基因簇pol克隆至p15A載體上，通過(guò)Red/ET重組工程技術(shù)將啟動(dòng)子、接合轉(zhuǎn)移元件以及位點(diǎn)特異性整合元件插入含有基因簇的重組質(zhì)粒上，最后通過(guò)phiC31介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性整合技術(shù)成功地將多氧霉素生物合成基因簇插入到鏈霉菌染色體上的attB位點(diǎn)，獲得了pol倍增菌株M1和M2（S.ansochromogenesPol-12：：Pori-pol，S.ansochromogenesPol-12：：PkasOp*-pol），其多氧霉素B的產(chǎn)量相對(duì)Pol-12菌株分別提高了22倍和33倍，說(shuō)明增加基因簇的拷貝數(shù)和運(yùn)用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)生物合成基因表達(dá)可有效提高多氧霉素的產(chǎn)量，本研究將為我國(guó)多氧霉素產(chǎn)業(yè)化水平的提升提供有益基礎(chǔ)。

組合生物合成是一種通過(guò)對(duì)不同次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行遺傳改造，從而獲得新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物或其衍生物的有效方法，Li等［29-30］通過(guò)該方法將負(fù)責(zé)多氧霉素二肽生物合成的基因?qū)氘a(chǎn)生尼可霉素核苷骨架的突變菌中，得到了兩種比多氧霉素B具有更高抗菌活性且比尼可霉素更穩(wěn)定的雜合抗生素polynik A和polyoxin N以及新的多氧霉素衍生物polyoxin O和polyoxin P；此外有文章報(bào)道將尼可霉素的相關(guān)合成基因轉(zhuǎn)到多氧霉素的產(chǎn)生菌中進(jìn)行異源表達(dá)，分離獲得了6種新穎的雜合抗生素nikkoxin B～G［31-32］，為研發(fā)抗菌活性更好的新型藥物提供了一種高效的策略。未來(lái)可以利用更多代謝工程和合成生物學(xué)手段在高產(chǎn)菌株中對(duì)多氧霉素生物合成途徑進(jìn)行改造，精確調(diào)控多氧霉素B或其他新活性組分的定向合成，進(jìn)一步特異性提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度。

致謝：本工作得到山東省泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目LJNY2015011的支持。感謝山東大學(xué)張友明教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予的大腸桿菌工程菌株及質(zhì)粒；感謝中國(guó)科學(xué)院微生物研究所王為善研究員贈(zèng)予的kasOp*啟動(dòng)子元件。