劉美霞，李強(qiáng)子，孟冬冬，魏欣蕾，游淳

（1中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；2中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

氧化還原酶是目前已報(bào)道酶中數(shù)量最大的酶類［1］。在體外合成生物學(xué)和生物代謝工程中，氧化還原酶被廣泛用于生產(chǎn)生物燃料、氨基酸、手性醇類、胺類、酮酸、抗生素以及天然產(chǎn)物等多種有機(jī)物［2-6］。氧化還原酶所催化的反應(yīng)中通常需要輔酶作為轉(zhuǎn)移電子、氫負(fù)離子、氫氣、氧氣或者其他小分子的中介體［2，7］。典型的輔酶包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、泛醌（ubiquinone，CoQ）、黃素輔因子（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN/flavin mononucleotide，F(xiàn)AD）等。其中，80%的氧化還原酶為NAD依賴型，只有10%的氧化還原酶依賴NADP進(jìn)行氫負(fù)離子（H+和2e-）的轉(zhuǎn)移和儲(chǔ)存。這兩個(gè)輔酶在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別非常小，NADP只是比NAD多了一個(gè)磷酸基團(tuán)［圖1（a）］。在微生物體內(nèi)和體外合成生物學(xué)中，嚴(yán)格輔酶偏好型氧化還原酶的失配將會(huì)導(dǎo)致輔酶不平衡［8］，工業(yè)生產(chǎn)中一旦輔酶的消耗和供應(yīng)無(wú)法匹配，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率將大大降低，因此輔酶的供應(yīng)、消耗以及其平衡對(duì)工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要［9-10］。

蛋白質(zhì)工程作為生物技術(shù)中一個(gè)強(qiáng)有力的工具［11］，常用于構(gòu)建高穩(wěn)定性、高酶活性、強(qiáng)特異性、高立體選擇性、廣底物譜的工程酶［12］。利用蛋白質(zhì)工程改造氧化還原酶對(duì)天然輔酶偏好性從而實(shí)現(xiàn)天然輔酶平衡，已成功用于工業(yè)菌發(fā)酵并使產(chǎn)物產(chǎn)量接近理論值［13］。仿生煙酰胺輔酶由于成本低、穩(wěn)定性高［14］、擴(kuò)散快（空間體積相對(duì)較?。?5］、電子傳遞速度快［16］等優(yōu)勢(shì)，可代替天然輔酶NAD（P）參與氧化還原反應(yīng)。將氧化還原酶輔酶偏好性從天然輔酶NAD（P）到仿生煙酰胺輔酶的改造將進(jìn)一步降低應(yīng)用成本［17-18］。此外，NAD（P）廣泛參與生物體內(nèi)復(fù)雜的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)，因此對(duì)生物體內(nèi)某一個(gè)或某一類氧化還原酶的功能的研究和調(diào)控較為困難?；诜律鸁燉０份o酶的生物正交系統(tǒng)可以增強(qiáng)對(duì)NAD（P）介導(dǎo)的細(xì)胞代謝通路的理解，并為氧化還原反應(yīng)的調(diào)控提供有效的策略［19-21］。

圖1 天然煙酰胺輔酶和仿生煙酰胺輔酶的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of natural nicotinamide-based coenzymes and biomimetic nicotinamide coenzymes

本文作者將詳細(xì)介紹煙酰胺輔酶依賴型氧化還原酶的輔酶偏好性改造所用到的設(shè)計(jì)策略和高通量篩選方法，以及這些偏好性改變的氧化還原酶在合成生物學(xué)中的應(yīng)用，特別是對(duì)仿生輔酶具有偏好性的氧化還原酶突變體在一些合成生物體系中的應(yīng)用。

1 氧化還原酶的輔酶偏好性改造方法

氧化還原酶的輔酶偏好性改造方法主要有3種：隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)［22-24］。這些方法的本質(zhì)是構(gòu)建分子多樣性文庫(kù)以及從文庫(kù)中篩選出期望的陽(yáng)性突變體。隨著蛋白質(zhì)分離純化和晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的快速發(fā)展，大量的酶結(jié)構(gòu)信息被解析。然而很多酶有效突變點(diǎn)的預(yù)測(cè)仍然十分困難，因此隨機(jī)突變是十分有效的改造手段。隨機(jī)突變一般通過(guò)易錯(cuò)PCR或基因改組構(gòu)建高通量隨機(jī)突變文庫(kù)從而篩選有效突變體［25-26］。相比而言，半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)借助了生物信息學(xué)方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬獲得潛在有益突變點(diǎn)［27-28］，再利用飽和突變或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行篩選，不但提高了陽(yáng)性突變率，而且大大縮小了突變文庫(kù)容量。

1.1 隨機(jī)突變

隨機(jī)突變是酶改造的常用手段，無(wú)需了解酶的晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制等背景知識(shí)，直接通過(guò)迭代有益突變篩選突變株，但由于工作量太大一般作為改變酶特性的最后解決方案。由于大多數(shù)NAD（P）依賴型的氧化還原酶具有高度保守的輔酶結(jié)合域Rossmann折疊［29-30］，半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)在氧化還原酶輔酶工程中應(yīng)用更為廣泛。

1.2 半理性設(shè)計(jì)

半理性設(shè)計(jì)是在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)上以多個(gè)特定殘基為標(biāo)靶進(jìn)行飽和突變，篩選突變文庫(kù)實(shí)現(xiàn)輔酶偏好性轉(zhuǎn)換。Sieber等［31］對(duì)硫葉菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶（SsGDH）進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，通過(guò)對(duì)輔酶口袋附近9個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，篩選到一個(gè)雙突變體Ile192Thr/Val306Ile，該突變變體相比野生型酶對(duì)仿生輔酶1-苯乙基-1，4-二氫吡啶-3-甲酰胺（P2NA）的酶活提高了10倍，并成功應(yīng)用于生產(chǎn)2-甲基丁烷。Zhao等改造亞磷酸脫氫酶（Pdh）獲得了一個(gè)可以利用人工輔酶煙酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）的突變體I151R/P176R/M207A，該突變體對(duì)NCD的酶活與野生型酶對(duì)NAD的酶活達(dá)到了同一個(gè)數(shù)量級(jí)。隨后，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)和機(jī)制解析總結(jié)出改造脫氫酶偏好NCD的一般規(guī)律，對(duì)于構(gòu)建工程酶高效利用仿生輔酶及其應(yīng)用具有重要意義［19］。

1.3 理性設(shè)計(jì)

輔酶工程的理性設(shè)計(jì)首先要確認(rèn)輔酶結(jié)合位點(diǎn)附近的殘基［32-33］，包括與2′-磷酸基團(tuán)［34］、腺苷基團(tuán)［35］以及煙酰胺基團(tuán)結(jié)合的殘基［36-39］。Chen等［36］對(duì)不同來(lái)源的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）的輔酶結(jié)合域進(jìn)行了多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6PGDH與NADP的2′-磷酸基團(tuán)之間存在一個(gè)相互作用的loop區(qū)［36］（圖2）。序列比對(duì)結(jié)果顯示NAD偏好的6PGDH在該loop區(qū)N端的Asp32位點(diǎn)高度保守，而NADP偏好的6PGDH在Asn32、Arg33和Ser/Thr34位點(diǎn)高度保守。定點(diǎn)突變海棲熱袍菌來(lái)源的6PGDH（Tm6PGDH）中這些保守氨基酸后，獲得最優(yōu)突變體N32E/R33I/T34I，該突變體對(duì)NAD的催化效率（kcat/Km）是對(duì)NADP的96倍［40-42］。此外，Li等［28］借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)枯草芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖脫氫酶（BsGDH）輔酶偏好進(jìn)行改造，改造后的突變體嚴(yán)格依賴仿生輔酶NMN參與氧化還原反應(yīng)，該NMN依賴型的突變體偶聯(lián)各種氧化還原酶被成功用于進(jìn)行體外酶促反應(yīng)。

圖2 不同來(lái)源的6PGDH輔酶結(jié)合域的多序列比對(duì)，框內(nèi)是輔酶識(shí)別的loop區(qū)Fig.2 Amino acid sequence alignment of coenzyme-binding motifs of various 6PGDH enzymes,residues composing loop region and responsible for coenzyme recognition are shown in red box

1.4 基于高通量篩選（HTS）的定向進(jìn)化方法

改造氧化還原酶使其偏好仿生輔酶是目前的一個(gè)熱門課題。天然酶通常對(duì)仿生輔酶具有較低酶活，因此高通量篩選方法需要消除細(xì)胞內(nèi)源性NAD（P）和還原性化合物的背景干擾?；谄桨甯咄亢Y選策略［14］，Huang等［43］發(fā)展了一種更高效的平板高通量篩選方法——NAD（P）消除固相分析法（NESPA）。此方法能在最小背景信號(hào)下可靠地篩選仿生輔酶偏好的陽(yáng)性突變體。具體步驟包括：①菌落高溫處理，增加細(xì)胞膜通透性；②菌落轉(zhuǎn)移到濾紙上；③洗滌濾紙去除內(nèi)源性NAD（P）和還原性化合物；④偶聯(lián)酶和電子中介體（IEC）顯色［圖3（a）］；⑤肉眼篩選陽(yáng)性突變體［圖3（b）］。NESPA被成功用于提高Tm6PGDH對(duì)煙酰胺單核苷酸（NMN）的活性，最優(yōu)突變體比野生型酶對(duì)NMN的催化效率（kcat/Km）提高了50倍，比酶活達(dá)到17.7 U/mg，與野生型酶對(duì)天然輔酶NADP的酶活相當(dāng)［43］。然而這種方法只適合于高熱穩(wěn)定性的氧化還原酶的改造工作。

圖3 使用NESPA法改造NAD（P）依賴型脫氫酶偏好仿生輔酶（mNAD）Fig.3 Schematic presentation of NESPA method for evolution of NAD(P)-dependent dehydrogenases to utilize biomimetic coenzyme mNAD

2 氧化還原酶的天然輔酶偏好性改造

輔酶NAD及其還原態(tài)NADH參與生物體內(nèi)多種代謝途徑，NAD（H）水平和NAD/NADH的比值在決定細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和代謝通量中起重要作用［10，44］。NAD一般通過(guò)酵母提取或微生物發(fā)酵獲得，也有通過(guò)全合成、半合成以及酶催化合成的報(bào)道。由于NADP比NAD昂貴很多，因此在體外合成生物學(xué)中，輔酶偏好性改造常常是從NADP到NAD。而在體內(nèi)合成生物學(xué)改造中，細(xì)胞內(nèi)部沒(méi)有輔酶成本的制約，輔酶改造可以雙向進(jìn)行，即從NADP到NAD或者NAD到NADP［45］。

2.1 NAD到NADP的改造

氨基酸是目前最大的發(fā)酵產(chǎn)物之一［46］，它的生產(chǎn)與NADPH水平密切相關(guān)。在谷氨酸棒狀桿菌中，每生產(chǎn)1 mol的賴氨酸需要4 mol的NADPH。可以通過(guò)糖酵解等途徑提高體內(nèi)NADPH的生產(chǎn)水平以提高賴氨酸的產(chǎn)量。但是糖酵解途徑主要由NAD依賴型氧化還原酶組成，Bommareddy等［47］通過(guò)理性設(shè)計(jì)的方式將谷氨酸棒狀桿菌中NAD依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶（CgGAPDH）的輔酶偏好改變?yōu)镹ADP依賴型。與野生型菌株相比，改造后的谷氨酸棒狀桿菌賴氨酸產(chǎn)量提高了60%。

工業(yè)構(gòu)建的用于乙醇生產(chǎn)的釀酒酵母菌株中包含畢赤酵母來(lái)源的木糖還原酶（PsXR）和木糖醇脫氫酶（PsXDH）。在乙醇生產(chǎn)中，NADPH依賴型的PsXR將木糖還原為木糖醇同時(shí)將NADPH氧化產(chǎn)生NADP，隨后木糖醇被NAD依賴型PsXDH氧化為木酮糖而NAD被還原為NADH，整個(gè)過(guò)程中輔酶的不平衡大大降低了乙醇的產(chǎn)量。將PsXR改造為NAD依賴型酶或者將PsXDH改造為NADP依賴型酶可以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的輔酶平衡。因此，Watanabe等［48-49］利用多位點(diǎn)飽和突變成功地將PsXDH的輔酶偏好性從NAD改造為NADP。這種改變大大提高了釀酒酵母對(duì)木糖的利用效率以及乙醇的產(chǎn)量，同時(shí)降低了木糖醇的積累［12］。

2.2 NADP到NAD的 改 造

大腸桿菌以葡萄糖為底物，可以通過(guò)修飾的支鏈氨基酸途徑合成異丁醇［13，38，50-52］。在這條代謝途徑中，糖酵解途徑消耗一分子葡萄糖生成兩分子NADH和兩分子丙酮酸。然而，每生成一分子異丁醇需要消耗兩分子NADPH，整個(gè)途徑輔酶嚴(yán)重不平衡。因此，需要在好氧或者微好氧條件下發(fā)酵，激活磷酸戊糖途徑或者三羧酸循環(huán)為生產(chǎn)異丁醇提供NADPH。除了優(yōu)化發(fā)酵條件外，改變氧化還原酶的輔酶偏好性是解決該困境的理想手段。Bastian等［13］將酮酸氧化還原異構(gòu)酶（KARI）和醇脫氫酶（ADH）改造為NADH依賴型，在厭氧條件下實(shí)現(xiàn)了異丁醇100%轉(zhuǎn)化。與異丁醇途徑相似，將輔酶偏好型由NADPH改造為NADH的XR和NAD依賴型XDH構(gòu)建到釀酒酵母中生產(chǎn)乙醇時(shí)［53-54］，乙醇的產(chǎn)量提高20%，木糖醇的積累下降52%。

3 氧化還原酶的仿生輔酶偏好性改造及其應(yīng)用

煙酰胺輔酶在手性化合物和醫(yī)藥前體化合物的合成上有著廣泛應(yīng)用，但是高成本、低穩(wěn)定性［55］的天然輔酶限制了其工業(yè)應(yīng)用。為了克服這一困難，近年來(lái)研究者們致力于合成仿生煙酰胺輔酶用于代替天然輔酶參與氧化還原反應(yīng)［56-57］。表1列出了本文中典型的氧化還原酶的仿生輔酶偏好性改造案例。天然輔酶按結(jié)構(gòu)可以分為負(fù)責(zé)傳遞氫和電子的煙酰胺單核苷酸（NMN）以及負(fù)責(zé)錨定輔酶與酶相互作用的腺苷磷酸（AMP）。仿生煙酰胺輔酶的合成主要是改變天然輔酶中的AMP部分［12］。仿生煙酰胺輔酶可以分為2類：半合成仿生輔酶，在結(jié)構(gòu)上與天然煙酰胺輔酶類似，通常是天然輔酶的截短形式（例如煙酰胺單核苷酸，NMN），或者僅對(duì)天然煙酰胺輔酶某些基團(tuán)做了修飾替換［圖1（b）］；全合成的仿生輔酶［57］，通?？臻g體積較?。ɡ鏝-芐基煙酰胺，BNA），僅保留了負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移的煙酰胺基團(tuán)［圖1（c）］。

表1 氧化還原酶對(duì)仿生煙酰胺輔酶mNADs偏好性的改造Tab.1 List of coenzyme engineering of oxidoreductases on biomimetic nicotinamide coenzymes mNADs

3.1 在體外合成生物學(xué)中的應(yīng)用

體外合成生物學(xué)是近幾年來(lái)新興的生物制造平臺(tái)，它具有可操作性強(qiáng)、產(chǎn)品產(chǎn)率高、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)［59-61］，被成功應(yīng)用于生產(chǎn)氫氣、生物電等生物化學(xué)品［3，62-65］。利用體外合成生物學(xué)生產(chǎn)電、氫氣、氨基酸、醇類以及胺類等物質(zhì)時(shí)，通常涉及輔酶的氧化與還原［62，66-73］。由于輔酶價(jià)格昂貴，因此在體外合成途徑中少使用、循環(huán)使用或者不使用輔酶，能有效降低生產(chǎn)成本［74］。在體外合成途徑中，使用高穩(wěn)定、低成本的仿生輔酶替代不穩(wěn)定、昂貴的天然輔酶是降低輔酶使用成本的另一有效方法。氫氣被認(rèn)為是未來(lái)最有前途的清潔能源。利用生物體外合成路徑產(chǎn)氫具有產(chǎn)率高、速率快、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。產(chǎn)氫途徑中需要用到兩個(gè)關(guān)鍵的脫氫酶：葡萄糖6-磷酸脫氫酶（G6PDH）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）。這兩個(gè)酶利用輔酶（NADP）直接將電子傳遞給氫酶，經(jīng)氫酶催化發(fā)生氧化還原反應(yīng)生產(chǎn)氫氣。改造G6PDH和6PGDH的輔酶偏好性，使其能夠利用仿生輔酶，是體外合成途徑生產(chǎn)氫氣過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。Huang等［43］利用定點(diǎn)飽和突變和隨機(jī)突變的方式對(duì)Tm6PGDH進(jìn)行輔酶偏好性改造。與野生型相比，突變體對(duì)NMN比酶活提高了近30倍［圖4（a）］。突變型6PGDH利用NMN作為輔酶與野生型6PGDH利用NADP具有相同的甲基環(huán)己酮產(chǎn)率［圖4（b）］。此外，作者課題組以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）來(lái)源的G6PDH作為研究對(duì)象，通過(guò)4輪定點(diǎn)飽和突變和組合突變，同樣實(shí)現(xiàn)了該酶由NADP依賴型到NMN依賴型的輔酶偏好性改造（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。然而，突變型G6PDH和6PGDH對(duì)NMN的米氏常數(shù)（Km）仍然較高，不利于其在體外合成生物體系手性醇、生物電等方面的應(yīng)用。通過(guò)酶工程改造降低該酶對(duì)NMN的Km值是未來(lái)的重要研究方向。

圖4 定向進(jìn)化提高6PGDH對(duì)NMN的活性及其應(yīng)用Fig.4 Directed evolution to improve 6PGDH activity on NMN and its application

3.2 在生物正交系統(tǒng)中的應(yīng)用

盡管許多氨基酸類［75-76］、有機(jī)酸類、手性藥物等化學(xué)品已經(jīng)能夠通過(guò)代謝工程改造菌株進(jìn)行生產(chǎn)［77-82］，但由于生產(chǎn)力、效價(jià)和產(chǎn)量較低，能夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)的例子仍然很少。在生物體內(nèi)，大量氧化還原反應(yīng)通過(guò)天然輔酶NAD（P）進(jìn)行電子傳遞，這些氧化還原酶并不能利用人工輔酶。因此，通過(guò)構(gòu)建生物正交體系，將代謝途徑中的某個(gè)或某些氧化還原酶及其天然輔酶用氧化還原酶突變體及人工輔酶替代，對(duì)于解析微生物代謝機(jī)制、代謝流走向、微生物生理生化性質(zhì)具有重要的研究意義。研究人員通過(guò)對(duì)氧化還原酶與煙酰胺輔酶結(jié)合規(guī)律的研究，結(jié)合理性設(shè)計(jì)方法，實(shí)現(xiàn)了BsGDH的輔酶偏好性由嚴(yán)格NAD（P）依賴型到嚴(yán)格NMN依賴型的改造。通過(guò)將仿生輔酶NMN偏好的突變型GDH與各種氧化還原酶偶聯(lián)，證明NMN在體外生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中可以支持多種酶促反應(yīng)，包括C＝C雙鍵、C≡C三鍵和硝基的還原以及為細(xì)胞色素P450傳遞電子的反應(yīng)。其中，對(duì)C＝C雙鍵的高還原效率和穩(wěn)定性可達(dá)到工業(yè)酶標(biāo)準(zhǔn)［28］。這套體系為實(shí)現(xiàn)代謝路線在工程菌中的正交化提供了有力支持。

NAD是胞內(nèi)不可或缺的輔酶，其水平的改變會(huì)導(dǎo)致全局性且難以預(yù)測(cè)的生物學(xué)效應(yīng)。為突破基于天然輔酶代謝調(diào)控的局限，中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的趙宗保研究員團(tuán)隊(duì)通過(guò)定向進(jìn)化獲得了多種氧化還原酶的非天然輔酶依賴型突變體，并構(gòu)建出相應(yīng)的正交氧化還原催化體系。在對(duì)亞磷酸脫氫酶進(jìn)行輔酶偏好性改造基礎(chǔ)上，闡明了氧化還原酶輔酶偏好性改變的分子基礎(chǔ)，并構(gòu)建了亞磷酸驅(qū)動(dòng)的有機(jī)酸合成體系。除此之外，該團(tuán)隊(duì)還通過(guò)定向進(jìn)化獲得了NCD偏好型甲酸脫氫酶（FDH），在純酶水平與NCD偏好型蘋果酸酶（ME）突變體偶聯(lián)，構(gòu)建了新的正交氧化還原體系，證明其可利用甲酸來(lái)源的碳和還原力進(jìn)行丙酮酸還原羧化；同時(shí)在微生物細(xì)胞內(nèi)成功構(gòu)建了甲酸驅(qū)動(dòng)、NCD介導(dǎo)的蘋果酸生物合成體系。該研究逆轉(zhuǎn)了胞內(nèi)蘋果酸節(jié)點(diǎn)的代謝流方向，對(duì)人工設(shè)計(jì)代謝途徑、選擇性調(diào)控細(xì)胞物質(zhì)能量代謝具有重要參考價(jià)值（圖5）［19-20，58，83］。

圖5 由仿生輔酶NCD和NFCD與突變體酶蘋果酸酶（ME）、D-乳酸脫氫酶（DLDH）和甲酸脫氫酶（FDH）組成的仿生輔酶正交體系Fig.5 Cofactor orthogonal system of NCD and NFCD with mutated malic enzyme(ME),D-lactate dehydrogenase(DLDH)and formate dehydrogenase(FDH)

3.3 在酶燃料電池中的應(yīng)用

電極表面聚合物膜中酶的固定化在生物燃料電池和生物傳感器中有著廣泛的應(yīng)用［84-87］。與游離酶相比，固定化酶的使用減少了所需的酶量，大大提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和壽命［88-89］。然而，在該系統(tǒng)中輔酶的擴(kuò)散成為關(guān)鍵的限速步驟［90］。NAD的分子量約為663.43，體積龐大，在穿梭膜的過(guò)程中阻力較大，傳質(zhì)效果差。與NAD相比，NMN缺少腺嘌呤核糖核苷酸單元，只保留了以煙酰胺為底盤的氧化還原中心，傳質(zhì)速率更加快捷。Campbell等［15］通過(guò)定點(diǎn)飽和突變拓展了來(lái)源于Pyrococcus furiosus的醇脫氫酶（PfADH）的輔酶譜，使其能夠利用分子量更小的NMN，并將其應(yīng)用于酶燃料電池。與天然輔酶NAD相比，NMN構(gòu)建的生物燃料電池系統(tǒng)電流密度增加了40%。

3.4 氧化還原酶的BNA偏好性改造在高值化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用

BNA是一種典型的全合成仿生煙酰胺輔酶，也是被研究較多的仿生輔酶。Hollmann課題組［91］設(shè)計(jì)合成了一系列BNA類似物代替天然輔酶用于烯酸還原酶（ER）催化茶香酮及α，β-不飽和羰基化合物C＝C鍵的不對(duì)稱還原體系中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體選擇性均大于99%，且該體系已經(jīng)成功進(jìn)行了放大試驗(yàn)。Hauer等［92］將BNA中芐基替換為苯基，從而合成了1-苯基-1，4-二氫煙酰胺（PNAH）和1-（4-羥基苯基）-1，4-二氫煙酰胺（HPNAH）。來(lái)源于發(fā)酵單胞菌的2-環(huán)己烯-1-酮還原酶對(duì)PNAH的酶活與對(duì)天然輔酶NAD的酶活達(dá)到了同一個(gè)數(shù)量級(jí)。來(lái)源于Pseudomonas azelaicaHBP1的2-對(duì)苯基苯酚3-單氧酶可以利用BNA作為輔酶將羥基加在對(duì)苯基苯酚上形成鄰苯二酚［93］。同樣的，大腸桿菌來(lái)源的含有黃素的硝基還原酶也能利用人工輔酶BNA［94-95］。這些研究報(bào)道表明，高穩(wěn)定、低成本的全合成仿生輔酶具有替代昂貴、不穩(wěn)定的天然輔酶的應(yīng)用前景。然而，自然界中大部分氧化還原酶對(duì)仿生輔酶沒(méi)有活性，或者僅具有很弱的活性。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段對(duì)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的氧化還原酶進(jìn)行仿生輔酶偏好性改造，是提升高值化學(xué)品生物制造的有效手段。

4 總結(jié)與展望

由于不同類型的輔酶之間的差異、輔酶的供需平衡以及輔酶的成本和穩(wěn)定性問(wèn)題，對(duì)氧化還原酶的輔酶偏好性改造在生物代謝調(diào)控、工業(yè)醫(yī)藥以及體外合成生物方面都有著廣泛的應(yīng)用。隨著高分辨率蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)、同源氧化還原酶輔酶工程改造的不斷增加以及新型高通量篩選方法的不斷發(fā)展，NAD和NADP之間輔酶偏好性改造的蛋白質(zhì)工程日趨成熟。同時(shí)，高穩(wěn)定、低成本的仿生輔酶替代天然輔酶參與酶催化反應(yīng)變得越來(lái)越容易實(shí)現(xiàn)。

從含有大量突變體的文庫(kù)中篩選目的突變體目前依然是氧化還原酶輔酶工程改造的常用手段，因此高效準(zhǔn)確的高通量篩選方法的建立依然具有重要意義。液滴微流控高通量篩選平臺(tái)不僅能以低成本實(shí)現(xiàn)超高通量篩選酶庫(kù)，而且可以快速、有效識(shí)別和分離酶突變體，被廣泛應(yīng)用于酶定向進(jìn)化研究。目前，液滴微流控篩選體系應(yīng)用于氧化還原酶的仿生輔酶偏好性研究最大的難點(diǎn)在于細(xì)胞內(nèi)大量?jī)?nèi)源性天然輔酶對(duì)仿生輔酶的信號(hào)干擾。近期光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示天然輔酶與仿生輔酶在不同波長(zhǎng)下熒光壽命不同?；诖诵再|(zhì)差異，使用液滴微流控篩選仿生輔酶偏好的氧化還原酶將可能得以實(shí)現(xiàn)。

氧化還原酶的仿生輔酶偏好性研究是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域，為研究者提供了更多的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。構(gòu)建高效仿生輔酶再生體系同樣處于初級(jí)階段，大多數(shù)研究都集中在實(shí)驗(yàn)室水平，還沒(méi)有成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的案例。過(guò)去關(guān)于酶與仿生輔酶結(jié)合的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)非常有限，酶與仿生輔酶相互作用機(jī)制仍不清晰，仿生輔酶相關(guān)的蛋白質(zhì)改造工程一直沒(méi)有普適的理論指導(dǎo)。然而隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多天然酶元件被發(fā)現(xiàn)具有仿生輔酶活性；同時(shí)根據(jù)現(xiàn)有仿生輔酶的研究基礎(chǔ)，更多具有高穩(wěn)定性、優(yōu)異溶解性以及與酶元件高度兼容性的新的仿生輔酶（PNA、HPNA、NCD、NFCD）被理性設(shè)計(jì)并合成出來(lái)。這些成果為未來(lái)氧化還原酶的輔酶工程研究提供了方向和堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。