亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        煙酰胺類輔酶依賴型氧化還原酶的輔酶偏好性改造及其在合成生物學中的應用

        2020-12-24 11:03:14劉美霞李強子孟冬冬魏欣蕾游淳
        合成生物學 2020年5期
        關鍵詞:依賴型煙酰胺還原酶

        劉美霞,李強子,孟冬冬,魏欣蕾,游淳

        (1中國科學院大學,北京100049;2中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所,天津300308)

        氧化還原酶是目前已報道酶中數(shù)量最大的酶類[1]。在體外合成生物學和生物代謝工程中,氧化還原酶被廣泛用于生產生物燃料、氨基酸、手性醇類、胺類、酮酸、抗生素以及天然產物等多種有機物[2-6]。氧化還原酶所催化的反應中通常需要輔酶作為轉移電子、氫負離子、氫氣、氧氣或者其他小分子的中介體[2,7]。典型的輔酶包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)、泛醌(ubiquinone,CoQ)、黃素輔因子(flavin mononucleotide,F(xiàn)MN/flavin mononucleotide,F(xiàn)AD)等。其中,80%的氧化還原酶為NAD依賴型,只有10%的氧化還原酶依賴NADP進行氫負離子(H+和2e-)的轉移和儲存。這兩個輔酶在結構上的區(qū)別非常小,NADP只是比NAD多了一個磷酸基團[圖1(a)]。在微生物體內和體外合成生物學中,嚴格輔酶偏好型氧化還原酶的失配將會導致輔酶不平衡[8],工業(yè)生產中一旦輔酶的消耗和供應無法匹配,目的產物的產量和生產速率將大大降低,因此輔酶的供應、消耗以及其平衡對工業(yè)生產至關重要[9-10]。

        蛋白質工程作為生物技術中一個強有力的工具[11],常用于構建高穩(wěn)定性、高酶活性、強特異性、高立體選擇性、廣底物譜的工程酶[12]。利用蛋白質工程改造氧化還原酶對天然輔酶偏好性從而實現(xiàn)天然輔酶平衡,已成功用于工業(yè)菌發(fā)酵并使產物產量接近理論值[13]。仿生煙酰胺輔酶由于成本低、穩(wěn)定性高[14]、擴散快(空間體積相對較?。?5]、電子傳遞速度快[16]等優(yōu)勢,可代替天然輔酶NAD(P)參與氧化還原反應。將氧化還原酶輔酶偏好性從天然輔酶NAD(P)到仿生煙酰胺輔酶的改造將進一步降低應用成本[17-18]。此外,NAD(P)廣泛參與生物體內復雜的新陳代謝網絡,因此對生物體內某一個或某一類氧化還原酶的功能的研究和調控較為困難?;诜律鸁燉0份o酶的生物正交系統(tǒng)可以增強對NAD(P)介導的細胞代謝通路的理解,并為氧化還原反應的調控提供有效的策略[19-21]。

        圖1 天然煙酰胺輔酶和仿生煙酰胺輔酶的結構Fig.1 Structures of natural nicotinamide-based coenzymes and biomimetic nicotinamide coenzymes

        本文作者將詳細介紹煙酰胺輔酶依賴型氧化還原酶的輔酶偏好性改造所用到的設計策略和高通量篩選方法,以及這些偏好性改變的氧化還原酶在合成生物學中的應用,特別是對仿生輔酶具有偏好性的氧化還原酶突變體在一些合成生物體系中的應用。

        1 氧化還原酶的輔酶偏好性改造方法

        氧化還原酶的輔酶偏好性改造方法主要有3種:隨機突變、半理性設計和理性設計[22-24]。這些方法的本質是構建分子多樣性文庫以及從文庫中篩選出期望的陽性突變體。隨著蛋白質分離純化和晶體結構解析技術的快速發(fā)展,大量的酶結構信息被解析。然而很多酶有效突變點的預測仍然十分困難,因此隨機突變是十分有效的改造手段。隨機突變一般通過易錯PCR或基因改組構建高通量隨機突變文庫從而篩選有效突變體[25-26]。相比而言,半理性設計和理性設計借助了生物信息學方法,通過計算機模擬獲得潛在有益突變點[27-28],再利用飽和突變或定點突變技術進行篩選,不但提高了陽性突變率,而且大大縮小了突變文庫容量。

        1.1 隨機突變

        隨機突變是酶改造的常用手段,無需了解酶的晶體結構和催化機制等背景知識,直接通過迭代有益突變篩選突變株,但由于工作量太大一般作為改變酶特性的最后解決方案。由于大多數(shù)NAD(P)依賴型的氧化還原酶具有高度保守的輔酶結合域Rossmann折疊[29-30],半理性設計和理性設計在氧化還原酶輔酶工程中應用更為廣泛。

        1.2 半理性設計

        半理性設計是在蛋白質結構和功能基礎上以多個特定殘基為標靶進行飽和突變,篩選突變文庫實現(xiàn)輔酶偏好性轉換。Sieber等[31]對硫葉菌來源的葡萄糖脫氫酶(SsGDH)進行理性設計,通過對輔酶口袋附近9個氨基酸殘基進行定點飽和突變,篩選到一個雙突變體Ile192Thr/Val306Ile,該突變變體相比野生型酶對仿生輔酶1-苯乙基-1,4-二氫吡啶-3-甲酰胺(P2NA)的酶活提高了10倍,并成功應用于生產2-甲基丁烷。Zhao等改造亞磷酸脫氫酶(Pdh)獲得了一個可以利用人工輔酶煙酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)的突變體I151R/P176R/M207A,該突變體對NCD的酶活與野生型酶對NAD的酶活達到了同一個數(shù)量級。隨后,該團隊通過晶體結構和機制解析總結出改造脫氫酶偏好NCD的一般規(guī)律,對于構建工程酶高效利用仿生輔酶及其應用具有重要意義[19]。

        1.3 理性設計

        輔酶工程的理性設計首先要確認輔酶結合位點附近的殘基[32-33],包括與2′-磷酸基團[34]、腺苷基團[35]以及煙酰胺基團結合的殘基[36-39]。Chen等[36]對不同來源的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)的輔酶結合域進行了多序列比對,發(fā)現(xiàn)6PGDH與NADP的2′-磷酸基團之間存在一個相互作用的loop區(qū)[36](圖2)。序列比對結果顯示NAD偏好的6PGDH在該loop區(qū)N端的Asp32位點高度保守,而NADP偏好的6PGDH在Asn32、Arg33和Ser/Thr34位點高度保守。定點突變海棲熱袍菌來源的6PGDH(Tm6PGDH)中這些保守氨基酸后,獲得最優(yōu)突變體N32E/R33I/T34I,該突變體對NAD的催化效率(kcat/Km)是對NADP的96倍[40-42]。此外,Li等[28]借助計算機輔助設計,對枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶(BsGDH)輔酶偏好進行改造,改造后的突變體嚴格依賴仿生輔酶NMN參與氧化還原反應,該NMN依賴型的突變體偶聯(lián)各種氧化還原酶被成功用于進行體外酶促反應。

        圖2 不同來源的6PGDH輔酶結合域的多序列比對,框內是輔酶識別的loop區(qū)Fig.2 Amino acid sequence alignment of coenzyme-binding motifs of various 6PGDH enzymes,residues composing loop region and responsible for coenzyme recognition are shown in red box

        1.4 基于高通量篩選(HTS)的定向進化方法

        改造氧化還原酶使其偏好仿生輔酶是目前的一個熱門課題。天然酶通常對仿生輔酶具有較低酶活,因此高通量篩選方法需要消除細胞內源性NAD(P)和還原性化合物的背景干擾。基于平板高通量篩選策略[14],Huang等[43]發(fā)展了一種更高效的平板高通量篩選方法——NAD(P)消除固相分析法(NESPA)。此方法能在最小背景信號下可靠地篩選仿生輔酶偏好的陽性突變體。具體步驟包括:①菌落高溫處理,增加細胞膜通透性;②菌落轉移到濾紙上;③洗滌濾紙去除內源性NAD(P)和還原性化合物;④偶聯(lián)酶和電子中介體(IEC)顯色[圖3(a)];⑤肉眼篩選陽性突變體[圖3(b)]。NESPA被成功用于提高Tm6PGDH對煙酰胺單核苷酸(NMN)的活性,最優(yōu)突變體比野生型酶對NMN的催化效率(kcat/Km)提高了50倍,比酶活達到17.7 U/mg,與野生型酶對天然輔酶NADP的酶活相當[43]。然而這種方法只適合于高熱穩(wěn)定性的氧化還原酶的改造工作。

        圖3 使用NESPA法改造NAD(P)依賴型脫氫酶偏好仿生輔酶(mNAD)Fig.3 Schematic presentation of NESPA method for evolution of NAD(P)-dependent dehydrogenases to utilize biomimetic coenzyme mNAD

        2 氧化還原酶的天然輔酶偏好性改造

        輔酶NAD及其還原態(tài)NADH參與生物體內多種代謝途徑,NAD(H)水平和NAD/NADH的比值在決定細胞氧化還原狀態(tài)和代謝通量中起重要作用[10,44]。NAD一般通過酵母提取或微生物發(fā)酵獲得,也有通過全合成、半合成以及酶催化合成的報道。由于NADP比NAD昂貴很多,因此在體外合成生物學中,輔酶偏好性改造常常是從NADP到NAD。而在體內合成生物學改造中,細胞內部沒有輔酶成本的制約,輔酶改造可以雙向進行,即從NADP到NAD或者NAD到NADP[45]。

        2.1 NAD到NADP的改造

        氨基酸是目前最大的發(fā)酵產物之一[46],它的生產與NADPH水平密切相關。在谷氨酸棒狀桿菌中,每生產1 mol的賴氨酸需要4 mol的NADPH??梢酝ㄟ^糖酵解等途徑提高體內NADPH的生產水平以提高賴氨酸的產量。但是糖酵解途徑主要由NAD依賴型氧化還原酶組成,Bommareddy等[47]通過理性設計的方式將谷氨酸棒狀桿菌中NAD依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶(CgGAPDH)的輔酶偏好改變?yōu)镹ADP依賴型。與野生型菌株相比,改造后的谷氨酸棒狀桿菌賴氨酸產量提高了60%。

        工業(yè)構建的用于乙醇生產的釀酒酵母菌株中包含畢赤酵母來源的木糖還原酶(PsXR)和木糖醇脫氫酶(PsXDH)。在乙醇生產中,NADPH依賴型的PsXR將木糖還原為木糖醇同時將NADPH氧化產生NADP,隨后木糖醇被NAD依賴型PsXDH氧化為木酮糖而NAD被還原為NADH,整個過程中輔酶的不平衡大大降低了乙醇的產量。將PsXR改造為NAD依賴型酶或者將PsXDH改造為NADP依賴型酶可以實現(xiàn)系統(tǒng)的輔酶平衡。因此,Watanabe等[48-49]利用多位點飽和突變成功地將PsXDH的輔酶偏好性從NAD改造為NADP。這種改變大大提高了釀酒酵母對木糖的利用效率以及乙醇的產量,同時降低了木糖醇的積累[12]。

        2.2 NADP到NAD的 改 造

        大腸桿菌以葡萄糖為底物,可以通過修飾的支鏈氨基酸途徑合成異丁醇[13,38,50-52]。在這條代謝途徑中,糖酵解途徑消耗一分子葡萄糖生成兩分子NADH和兩分子丙酮酸。然而,每生成一分子異丁醇需要消耗兩分子NADPH,整個途徑輔酶嚴重不平衡。因此,需要在好氧或者微好氧條件下發(fā)酵,激活磷酸戊糖途徑或者三羧酸循環(huán)為生產異丁醇提供NADPH。除了優(yōu)化發(fā)酵條件外,改變氧化還原酶的輔酶偏好性是解決該困境的理想手段。Bastian等[13]將酮酸氧化還原異構酶(KARI)和醇脫氫酶(ADH)改造為NADH依賴型,在厭氧條件下實現(xiàn)了異丁醇100%轉化。與異丁醇途徑相似,將輔酶偏好型由NADPH改造為NADH的XR和NAD依賴型XDH構建到釀酒酵母中生產乙醇時[53-54],乙醇的產量提高20%,木糖醇的積累下降52%。

        3 氧化還原酶的仿生輔酶偏好性改造及其應用

        煙酰胺輔酶在手性化合物和醫(yī)藥前體化合物的合成上有著廣泛應用,但是高成本、低穩(wěn)定性[55]的天然輔酶限制了其工業(yè)應用。為了克服這一困難,近年來研究者們致力于合成仿生煙酰胺輔酶用于代替天然輔酶參與氧化還原反應[56-57]。表1列出了本文中典型的氧化還原酶的仿生輔酶偏好性改造案例。天然輔酶按結構可以分為負責傳遞氫和電子的煙酰胺單核苷酸(NMN)以及負責錨定輔酶與酶相互作用的腺苷磷酸(AMP)。仿生煙酰胺輔酶的合成主要是改變天然輔酶中的AMP部分[12]。仿生煙酰胺輔酶可以分為2類:半合成仿生輔酶,在結構上與天然煙酰胺輔酶類似,通常是天然輔酶的截短形式(例如煙酰胺單核苷酸,NMN),或者僅對天然煙酰胺輔酶某些基團做了修飾替換[圖1(b)];全合成的仿生輔酶[57],通??臻g體積較?。ɡ鏝-芐基煙酰胺,BNA),僅保留了負責電子轉移的煙酰胺基團[圖1(c)]。

        表1 氧化還原酶對仿生煙酰胺輔酶mNADs偏好性的改造Tab.1 List of coenzyme engineering of oxidoreductases on biomimetic nicotinamide coenzymes mNADs

        3.1 在體外合成生物學中的應用

        體外合成生物學是近幾年來新興的生物制造平臺,它具有可操作性強、產品產率高、反應速度快等特點[59-61],被成功應用于生產氫氣、生物電等生物化學品[3,62-65]。利用體外合成生物學生產電、氫氣、氨基酸、醇類以及胺類等物質時,通常涉及輔酶的氧化與還原[62,66-73]。由于輔酶價格昂貴,因此在體外合成途徑中少使用、循環(huán)使用或者不使用輔酶,能有效降低生產成本[74]。在體外合成途徑中,使用高穩(wěn)定、低成本的仿生輔酶替代不穩(wěn)定、昂貴的天然輔酶是降低輔酶使用成本的另一有效方法。氫氣被認為是未來最有前途的清潔能源。利用生物體外合成路徑產氫具有產率高、速率快、無污染等優(yōu)點。產氫途徑中需要用到兩個關鍵的脫氫酶:葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)。這兩個酶利用輔酶(NADP)直接將電子傳遞給氫酶,經氫酶催化發(fā)生氧化還原反應生產氫氣。改造G6PDH和6PGDH的輔酶偏好性,使其能夠利用仿生輔酶,是體外合成途徑生產氫氣過程中亟待解決的問題。Huang等[43]利用定點飽和突變和隨機突變的方式對Tm6PGDH進行輔酶偏好性改造。與野生型相比,突變體對NMN比酶活提高了近30倍[圖4(a)]。突變型6PGDH利用NMN作為輔酶與野生型6PGDH利用NADP具有相同的甲基環(huán)己酮產率[圖4(b)]。此外,作者課題組以運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)來源的G6PDH作為研究對象,通過4輪定點飽和突變和組合突變,同樣實現(xiàn)了該酶由NADP依賴型到NMN依賴型的輔酶偏好性改造(未發(fā)表數(shù)據(jù))。然而,突變型G6PDH和6PGDH對NMN的米氏常數(shù)(Km)仍然較高,不利于其在體外合成生物體系手性醇、生物電等方面的應用。通過酶工程改造降低該酶對NMN的Km值是未來的重要研究方向。

        圖4 定向進化提高6PGDH對NMN的活性及其應用Fig.4 Directed evolution to improve 6PGDH activity on NMN and its application

        3.2 在生物正交系統(tǒng)中的應用

        盡管許多氨基酸類[75-76]、有機酸類、手性藥物等化學品已經能夠通過代謝工程改造菌株進行生產[77-82],但由于生產力、效價和產量較低,能夠進行實驗室規(guī)模生產的例子仍然很少。在生物體內,大量氧化還原反應通過天然輔酶NAD(P)進行電子傳遞,這些氧化還原酶并不能利用人工輔酶。因此,通過構建生物正交體系,將代謝途徑中的某個或某些氧化還原酶及其天然輔酶用氧化還原酶突變體及人工輔酶替代,對于解析微生物代謝機制、代謝流走向、微生物生理生化性質具有重要的研究意義。研究人員通過對氧化還原酶與煙酰胺輔酶結合規(guī)律的研究,結合理性設計方法,實現(xiàn)了BsGDH的輔酶偏好性由嚴格NAD(P)依賴型到嚴格NMN依賴型的改造。通過將仿生輔酶NMN偏好的突變型GDH與各種氧化還原酶偶聯(lián),證明NMN在體外生物轉化過程中可以支持多種酶促反應,包括C=C雙鍵、C≡C三鍵和硝基的還原以及為細胞色素P450傳遞電子的反應。其中,對C=C雙鍵的高還原效率和穩(wěn)定性可達到工業(yè)酶標準[28]。這套體系為實現(xiàn)代謝路線在工程菌中的正交化提供了有力支持。

        NAD是胞內不可或缺的輔酶,其水平的改變會導致全局性且難以預測的生物學效應。為突破基于天然輔酶代謝調控的局限,中國科學院大連化學物理研究所的趙宗保研究員團隊通過定向進化獲得了多種氧化還原酶的非天然輔酶依賴型突變體,并構建出相應的正交氧化還原催化體系。在對亞磷酸脫氫酶進行輔酶偏好性改造基礎上,闡明了氧化還原酶輔酶偏好性改變的分子基礎,并構建了亞磷酸驅動的有機酸合成體系。除此之外,該團隊還通過定向進化獲得了NCD偏好型甲酸脫氫酶(FDH),在純酶水平與NCD偏好型蘋果酸酶(ME)突變體偶聯(lián),構建了新的正交氧化還原體系,證明其可利用甲酸來源的碳和還原力進行丙酮酸還原羧化;同時在微生物細胞內成功構建了甲酸驅動、NCD介導的蘋果酸生物合成體系。該研究逆轉了胞內蘋果酸節(jié)點的代謝流方向,對人工設計代謝途徑、選擇性調控細胞物質能量代謝具有重要參考價值(圖5)[19-20,58,83]。

        圖5 由仿生輔酶NCD和NFCD與突變體酶蘋果酸酶(ME)、D-乳酸脫氫酶(DLDH)和甲酸脫氫酶(FDH)組成的仿生輔酶正交體系Fig.5 Cofactor orthogonal system of NCD and NFCD with mutated malic enzyme(ME),D-lactate dehydrogenase(DLDH)and formate dehydrogenase(FDH)

        3.3 在酶燃料電池中的應用

        電極表面聚合物膜中酶的固定化在生物燃料電池和生物傳感器中有著廣泛的應用[84-87]。與游離酶相比,固定化酶的使用減少了所需的酶量,大大提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和壽命[88-89]。然而,在該系統(tǒng)中輔酶的擴散成為關鍵的限速步驟[90]。NAD的分子量約為663.43,體積龐大,在穿梭膜的過程中阻力較大,傳質效果差。與NAD相比,NMN缺少腺嘌呤核糖核苷酸單元,只保留了以煙酰胺為底盤的氧化還原中心,傳質速率更加快捷。Campbell等[15]通過定點飽和突變拓展了來源于Pyrococcus furiosus的醇脫氫酶(PfADH)的輔酶譜,使其能夠利用分子量更小的NMN,并將其應用于酶燃料電池。與天然輔酶NAD相比,NMN構建的生物燃料電池系統(tǒng)電流密度增加了40%。

        3.4 氧化還原酶的BNA偏好性改造在高值化學品生產中的應用

        BNA是一種典型的全合成仿生煙酰胺輔酶,也是被研究較多的仿生輔酶。Hollmann課題組[91]設計合成了一系列BNA類似物代替天然輔酶用于烯酸還原酶(ER)催化茶香酮及α,β-不飽和羰基化合物C=C鍵的不對稱還原體系中。實驗結果表明反應轉化率和產物的對映體選擇性均大于99%,且該體系已經成功進行了放大試驗。Hauer等[92]將BNA中芐基替換為苯基,從而合成了1-苯基-1,4-二氫煙酰胺(PNAH)和1-(4-羥基苯基)-1,4-二氫煙酰胺(HPNAH)。來源于發(fā)酵單胞菌的2-環(huán)己烯-1-酮還原酶對PNAH的酶活與對天然輔酶NAD的酶活達到了同一個數(shù)量級。來源于Pseudomonas azelaicaHBP1的2-對苯基苯酚3-單氧酶可以利用BNA作為輔酶將羥基加在對苯基苯酚上形成鄰苯二酚[93]。同樣的,大腸桿菌來源的含有黃素的硝基還原酶也能利用人工輔酶BNA[94-95]。這些研究報道表明,高穩(wěn)定、低成本的全合成仿生輔酶具有替代昂貴、不穩(wěn)定的天然輔酶的應用前景。然而,自然界中大部分氧化還原酶對仿生輔酶沒有活性,或者僅具有很弱的活性。因此,通過蛋白質工程手段對具有工業(yè)應用價值的氧化還原酶進行仿生輔酶偏好性改造,是提升高值化學品生物制造的有效手段。

        4 總結與展望

        由于不同類型的輔酶之間的差異、輔酶的供需平衡以及輔酶的成本和穩(wěn)定性問題,對氧化還原酶的輔酶偏好性改造在生物代謝調控、工業(yè)醫(yī)藥以及體外合成生物方面都有著廣泛的應用。隨著高分辨率蛋白質晶體結構、同源氧化還原酶輔酶工程改造的不斷增加以及新型高通量篩選方法的不斷發(fā)展,NAD和NADP之間輔酶偏好性改造的蛋白質工程日趨成熟。同時,高穩(wěn)定、低成本的仿生輔酶替代天然輔酶參與酶催化反應變得越來越容易實現(xiàn)。

        從含有大量突變體的文庫中篩選目的突變體目前依然是氧化還原酶輔酶工程改造的常用手段,因此高效準確的高通量篩選方法的建立依然具有重要意義。液滴微流控高通量篩選平臺不僅能以低成本實現(xiàn)超高通量篩選酶庫,而且可以快速、有效識別和分離酶突變體,被廣泛應用于酶定向進化研究。目前,液滴微流控篩選體系應用于氧化還原酶的仿生輔酶偏好性研究最大的難點在于細胞內大量內源性天然輔酶對仿生輔酶的信號干擾。近期光譜實驗數(shù)據(jù)顯示天然輔酶與仿生輔酶在不同波長下熒光壽命不同。基于此性質差異,使用液滴微流控篩選仿生輔酶偏好的氧化還原酶將可能得以實現(xiàn)。

        氧化還原酶的仿生輔酶偏好性研究是一個相對較新的領域,為研究者提供了更多的機遇和挑戰(zhàn)。構建高效仿生輔酶再生體系同樣處于初級階段,大多數(shù)研究都集中在實驗室水平,還沒有成功應用于工業(yè)生產的案例。過去關于酶與仿生輔酶結合的蛋白質晶體結構非常有限,酶與仿生輔酶相互作用機制仍不清晰,仿生輔酶相關的蛋白質改造工程一直沒有普適的理論指導。然而隨著時間的推移,越來越多天然酶元件被發(fā)現(xiàn)具有仿生輔酶活性;同時根據(jù)現(xiàn)有仿生輔酶的研究基礎,更多具有高穩(wěn)定性、優(yōu)異溶解性以及與酶元件高度兼容性的新的仿生輔酶(PNA、HPNA、NCD、NFCD)被理性設計并合成出來。這些成果為未來氧化還原酶的輔酶工程研究提供了方向和堅實的基礎。

        猜你喜歡
        依賴型煙酰胺還原酶
        木薯UDP依賴型糖基轉移酶14基因在木薯抗病性中的功能研究
        Fe/α-酮戊二酸依賴型鹵化酶在綠色鹵化反應中的研究進展
        合成生物學(2022年3期)2022-07-15 11:51:26
        四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病嚴重程度的相關性
        Effect of in ovo zinc injection on the embryonic development,tissue zinc contents, antioxidation, and related gene expressions of broiler breeder eggs
        煙酰胺甲基化反應機理的理論研究
        雙跳-擴散過程下時間依賴型的脆弱期權定價
        發(fā)酵液中酮基還原酶活性測定方法的構建
        中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:15
        煙酰胺在皮膚科的應用進展
        5-異煙酰胺異鈦酸構筑的Cu(Ⅰ)-Eu和Ni(Ⅱ)-Eu化合物的合成、晶體結構和性質研究
        羰基還原酶不對稱還原?-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯
        成人无码av免费网站| 中文熟女av一区二区| 视频一区中文字幕日韩| 国产精品一区二区性色| 激情综合色综合啪啪五月丁香| 国产91精品成人不卡在线观看| 99精品国产av一区二区| 黄片视频大全在线免费播放| 国产精品亚洲综合色区| 亚州综合激情另类久久久| 国产大陆av一区二区三区| 开心久久婷婷综合中文字幕| 内射人妻视频国内| 日韩精品无码区免费专区| 亚洲国产精品成人久久av| 青青草成人免费在线观看视频| 国产伦精品免编号公布| 日韩欧美一区二区三区中文精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫| 五月婷婷六月丁香久久综合| 日产亚洲一区二区三区| 亚洲成年网站在线777| 美女被搞在线观看一区二区三区| 日韩精品人妻久久久一二三| 色八区人妻在线视频免费| 欧美日韩一线| 国产日产韩国级片网站| 亚洲成a人片在线观看无码3d | 在线观看av中文字幕不卡| 性感人妻一区二区三区| 国产高清在线视频一区二区三区| 人妻丝袜av中文系列先锋影音| 国产精品原创巨作av无遮| 人妻熟女中文字幕av| 亚洲av无码一区东京热| 好男人视频在线视频| av一区二区不卡久久| 精品天堂色吊丝一区二区| 国产人妻久久精品二区三区| 亚洲一区精品中文字幕| 国产自拍视频在线观看免费|