王清，陳依軍

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院化學生物學研究室，江蘇南京211198）

由于天然產(chǎn)物含有大量生物活性相關(guān)特征的分子骨架和藥效團，如何將天然活性分子或藥效團發(fā)展成為臨床治療藥物一直是人們努力的目標［1-4］。長期以來，天然產(chǎn)物被視為臨床藥物的重要來源和藥物設(shè)計的寶貴源泉，尤其在抗腫瘤和抗感染領(lǐng)域［5-7］。據(jù)統(tǒng)計，在1981—2010年間獲批上市的1073種小分子藥物，直接來源于天然產(chǎn)物或者與天然產(chǎn)物相關(guān)的藥物約占64%，其中抗感染和抗腫瘤藥物方面與天然產(chǎn)物相關(guān)藥物所占的比例更高［8］。

盡管天然產(chǎn)物具有生物活性分子的天然優(yōu)勢，但是往往因具有以下特點，減緩了其研發(fā)過程甚至導致難以成藥：①受自然資源和生長條件等方面的限制，天然產(chǎn)物特別是植物來源的天然產(chǎn)物難以通過提取分離而獲得足夠的質(zhì)量，這種可及性限制常常阻礙活性分子的臨床前和臨床研究以及上市供應(yīng)；②隨著不斷的重復(fù)分離，從自然界發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)或新活性天然產(chǎn)物的概率變得越來越低；③天然產(chǎn)物通常存在水溶性差、活性不強、結(jié)構(gòu)類似物多等成藥性缺陷。對此，人們采用有機合成化學對天然產(chǎn)物進行了大量的設(shè)計和合成，產(chǎn)生自然界不存在的類天然產(chǎn)物。雖然這種策略和方法取得了重要進展并獲得了不少成功上市的藥物，但是分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、反應(yīng)條件的嚴苛性、合成路線的繁雜性等諸多因素制約了有機合成化學在天然藥物研發(fā)中的廣泛應(yīng)用。

與此同時，新的活性分子的發(fā)現(xiàn)僅是藥物研發(fā)過程的開端。由于天然產(chǎn)物通常存在理化性質(zhì)方面的缺陷，往往還需要十分漫長的優(yōu)化過程［9-11］。因此，亟需新的策略和手段進行天然產(chǎn)物的成藥性改造和優(yōu)化。鑒于合成生物學通過運用系統(tǒng)設(shè)計和工程化原理，設(shè)計并獲得基本的生物學元件、模塊和系統(tǒng)，使得創(chuàng)建人工生物合成體系、規(guī)?；ㄏ蛏锖铣尚滦突钚苑肿映蔀榭赡芎同F(xiàn)實［12-13］。因此，基于其靈活性、系統(tǒng)性、可操控性以及確定性，運用合成生物學的技術(shù)和手段改善天然產(chǎn)物的成藥性自然成為了一種有效的策略和工具。迄今，合成生物學策略和技術(shù)已在制備天然產(chǎn)物和改善其成藥性方面取得了一定進展，如達托霉素及衍生物的發(fā)現(xiàn)［14］和美登素的異源生產(chǎn)［15］等。本文作者就合成生物學策略和技術(shù)解決天然來源的藥物研發(fā)所面臨的主要問題進行概述和總結(jié)，期許有助于加速天然產(chǎn)物的成藥性改良以及新藥研發(fā)的進程。

1 增加水溶性

不論哪種給藥途徑，任何藥物均需要一定的水溶性才能制備成合適的劑型而用于臨床治療。然而，除多糖和寡糖類物質(zhì)外，絕大多數(shù)天然產(chǎn)物的水溶性不佳，導致其成為限制天然產(chǎn)物成藥的重要因素之一。針對水溶性低的問題，結(jié)構(gòu)修飾和改造是有效的解決辦法。由于酶和生物體系的高度位點和立體選擇性，通過合成生物學手段構(gòu)建體內(nèi)外水溶性修飾體系，定點改造化合物的骨架結(jié)構(gòu)，取得了較好的效果。這些修飾包括糖基化、羥化、磺酸化、磷酸化等，其中由于糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷合成酶廣泛存在于自然界而成為改善天然活性分子理化性質(zhì)的重要手段［16-17］。例如，甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是一種疏水性五環(huán)三萜化合物，具有多種生物活性。Liu等［18］應(yīng)用來自植物Barbarea vulgaris的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C11在大腸桿菌中重組表達，純化的UGT73C11體外催化UDP-葡萄糖和GA C-3位羥基經(jīng)β-糖苷鍵連接生成新化合物甘草次酸-3-O-單葡萄糖（GA-3-O-monoglucose）（圖1），糖基化修飾后的產(chǎn)物顯著提高了GA的水溶性和生物活性。此外，Liang等［19］利 用 真 菌（Cunninghamella elegansAS 3.2028）將具有抗動脈硬化活性的天然產(chǎn)物丹參酮轉(zhuǎn)化為兩種糖基化衍生物，其中對苯二酚丹參酮-11-O-β-D-葡萄糖苷的水溶性提高了50倍，同時小鼠口服吸收明顯改善。

硫肽類抗生素硫鏈絲菌素（thiostrepton，TSR）能夠有效殺死革蘭氏陽性耐藥菌，其結(jié)構(gòu)包含Loop2的雙環(huán)，側(cè)環(huán)含有一個喹啉酸（quinaldic acid，QA）［20-21］。其生物合成途徑中QA部分的形成涉及甲基轉(zhuǎn)移到L-色氨酸的吲哚環(huán)并發(fā)生重排，產(chǎn)生喹啉酮作為中間體。Wang等［22］通過對QA部分的選擇性修飾，生物合成了喹啉酮的5-氟化和12-甲基化的酯類似物。隨后，將類似物加入QA基因敲除菌株中。由于該敲除菌株缺少用于內(nèi)源生成喹啉酮的甲基轉(zhuǎn)移酶，生成了5′-氟-TSR和12′-甲基-TSR衍生物。這兩種衍生物的抗菌活性明顯增強，并且12′-甲基-TSR的水溶性提高了1.5倍，提高了其成藥的可能性。

圖1 甘草次酸糖基化形成甘草次酸-3-O-單葡萄糖Fig.1 Glycosylation of glycyrrhetinic acid to form GA-3-O-monoglucose

2 提高活性

天然產(chǎn)物的活性直接決定其臨床治療的有效性。在大多數(shù)情況下，從微生物或植物分離的天然產(chǎn)物通?；钚圆粔蝻@著，很難達到臨床治療所需的效果。因此，提高天然產(chǎn)物的活性成為了一個重要課題。雖然化學改造是一種有效的手段，但常常因母核結(jié)構(gòu)復(fù)雜而無法從根本上解決問題。與此同時，合成生物學可以通過藥效團和構(gòu)效關(guān)系分析，人工設(shè)計并定向合成其母核改變、結(jié)構(gòu)豐富的活性衍生物庫，經(jīng)篩選后獲得活性顯著提高的先導化合物或候選藥物。例如，Evans等［23］采用基于同源重組的等位基因替代策略，成功刪除了產(chǎn)生菌中非核糖體肽合成酶AdmK基因，將所得菌株用作表達AdmK突變體的宿主，通過構(gòu)效關(guān)系分析選擇激活非極性氨基酸的A結(jié)構(gòu)域，從定點飽和突變的位點中選擇了3個高度變異的殘基構(gòu)建了含有不同突變體的文庫。隨后，篩選得到了3個Andrimid衍生物，其抗金黃色葡萄球菌活性明顯增強。

由于建庫篩選耗時費力，人們轉(zhuǎn)向利用理性設(shè)計與組合生物合成的思路提高天然產(chǎn)物的活性。以二聚化為例，天然產(chǎn)物的二聚化通常有助于活性的提高。2018年，Matsuda等［24］通過基因敲除，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物Neosartorin生物合成基因簇nsr，并且發(fā)現(xiàn)P450酶NsrP能催化氧雜蒽酮發(fā)生異源二聚化。通過不同單體間的二聚化產(chǎn)生多樣化二聚體，新型二聚化產(chǎn)物體現(xiàn)出更好的抗菌活性。Alboflavusins（AFN）最初從黃鏈霉菌（Streptomyces alboflavussp.313）中獲得，是一種具有抗菌、抗腫瘤活性的環(huán)六肽［25-26］。AFN的生物合成屬于非核糖體肽合成酶機制，而其6-Cl-LTrp前體由位于afn基因簇外部的色氨酸鹵化酶基因形成。構(gòu)效關(guān)系分析表明，AFN的吡咯吲哚環(huán)上形成C5-C5′聯(lián)芳基二聚體，產(chǎn)物的活性會大幅增加。通過對AFN生物合成途徑相關(guān)基因的改造，可以產(chǎn)生AFN衍生物。隨后在S.alboflavus野生型和突變菌株中異源表達P450酶HmtS和Clps，以AFN為底物催化區(qū)域選擇性二聚化反應(yīng)，形成兩個二聚AFN（di-AFN）［27］（圖2）。通過體內(nèi)外驗證，二聚化AFNs的抗菌和抗腫瘤活性提高至單體的10～100倍。

此外，Hindra等［28］通過基因組挖掘發(fā)現(xiàn)了Streptomyces mobaraensisDSM40847含有博來霉素（bleomycin，BLM）基因簇。通過建立鏈霉菌的遺傳操作系統(tǒng)，在Streptomyces mobaraensisDSM40847基因組中沉默blmG基因構(gòu)建重組工程菌，產(chǎn)生了BLM類似物6′-脫氧BLM A2。6′-脫氧BLM A2對DNA的切割活性更高，表明改變BLM的二糖結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)其活性。

3 減少類似物

受自然環(huán)境、生長條件、生長周期、代謝調(diào)控等因素的影響，天然產(chǎn)物的產(chǎn)生經(jīng)常伴隨著很多結(jié)構(gòu)相似副產(chǎn)物的積累，但結(jié)構(gòu)上的微小差異往往導致天然產(chǎn)物之間活性差別較大。由于這些副產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似而難以分離，極大阻礙了天然產(chǎn)物的工藝開發(fā)和質(zhì)量控制。因此，通過對目標產(chǎn)物合成途徑及結(jié)構(gòu)差異的分析，改造和組裝生物合成途徑中關(guān)鍵酶的基因，再利用轉(zhuǎn)錄與代謝的調(diào)控，能夠增加目標天然產(chǎn)物的比例及產(chǎn)量。

圖2 白黃菌素的生物合成基因簇和二聚白黃菌素生物合成途徑改造Fig.2 AFNs biosynthetic gene cluster and manipulation of biosynthetic pathway for production on of di-AFNs

紅霉素（erythromycin）主要包含A、B、C、D四種成分，其中紅霉素A（Er-A）的活性最好，在臨床廣泛使用，并由此改造開發(fā)出具有良好抗菌活性的新藥（阿奇霉素、氟紅霉素和泰利霉素）［29-31］。為了提高Er-A的比例而減少其他組分，將紅霉素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora erythraeaHL3168 E3中8個attB位點的序列替換隱秘基因nrps1-1。然后，引入對Er-A生物合成具有重要影響的外源或內(nèi)源基因，包括用于正向調(diào)節(jié)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，用于增加氧氣供應(yīng)的vhb基因以及用于優(yōu)化后修飾的基因eryK（編碼C-12羥基化的P450酶基因）和eryG（編碼C-3O-甲基化的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因）［32］（圖3）。經(jīng)過這一系列改造，Er-A產(chǎn)量得到系統(tǒng)性提高并且副產(chǎn)物Er-B和Er-C被完全消除。

此外，酵母菌常用于生產(chǎn)乙酰輔酶A衍生物（聚酮化合物、萜類化合物等）［33-34］。因此，通過在Crabtree negative酵母設(shè)計轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號放大器，構(gòu)建了一個新的生物合成系統(tǒng)，使乙醇誘導表達能力提升近20倍［35］，將這種乙醇誘導型元件應(yīng)用于合成降血脂藥物辛伐他汀中間體莫納克林J。通過調(diào)控上下游生物合成途徑，并偶聯(lián)阻斷其競爭性途徑，使莫納克林J產(chǎn)量大幅提高，且無副產(chǎn)物累積。

4 提高可及性

許多天然產(chǎn)物具有良好的活性，但將其從天然宿主中提取分離或通過化學合成的方式無法獲得足夠的質(zhì)量，用于臨床研究和疾病治療。然而，分析這些化合物的生物合成途徑發(fā)現(xiàn)，它們均遵循生物合成邏輯而通過體內(nèi)相關(guān)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生。因此，人們可以通過對次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的改造和拼裝，人工構(gòu)建生物合成途徑，重新篩選并優(yōu)化底盤細胞，有效提高天然藥物的產(chǎn)量，提高先導化合物或藥物的可及性。重要天然產(chǎn)物如萜類［36］、聚酮［37］、非核糖體肽［38］和生物堿［39］均可通過合成生物學技術(shù)進行改造和生產(chǎn)，并且取得了一系列成功，產(chǎn)生了多個應(yīng)用于臨床的藥物。其中，最為突出的是，抗瘧藥青蒿素［40-41］、抗腫瘤藥紫杉醇［42］的生物合成在合成生物學技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物研究和開發(fā)歷史上具有里程碑式的意義。

圖3 紅霉素A的合成生物學改造Fig.3 Synthetic biology approach for production of erythromycin A

4.1 重構(gòu)生物合成途徑

在許多情況下，相關(guān)的代謝前體不能在原始宿主中大量產(chǎn)生，并且當中間產(chǎn)物不穩(wěn)定或相關(guān)酶活性較低都導致最終產(chǎn)物較少。合成生物學旨在創(chuàng)建能夠大量合成目標代謝物的新途徑，把部分反應(yīng)的模塊組合到新的生物合成通路中，調(diào)節(jié)通路中各個基因的表達水平，優(yōu)化代謝流和避免毒性中間體的積累。

甲硫氨酸是人體必需的氨基酸，具有抗氧化等多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的用途［43-44］。O-乙酰高絲氨酸（O-acetylhomoserine，OAH）是L-甲硫氨酸合成的重要前體，劉君教授與江會峰教授課題組［45］合作在大腸桿菌中重構(gòu)了OAH的生物合成途徑。通過代謝工程策略消除副產(chǎn)物的積累，增加草酰乙酸的供應(yīng)以及促進前體高絲氨酸的生物合成，通過定點突變等策略使限速酶的活性提高了12倍，達到了迄今所報道的OAH最高產(chǎn)量（圖4）。

圖4 O-乙酰高絲氨酸生物合成途徑及改造PEP—磷酸烯醇丙酮酸；PYR—丙酮酸；OAA—草酰乙酸；ACE—醋酸鹽；HSE—L-高絲氨酸；MetX—乙酰轉(zhuǎn)移酶Fig.4 Synthetic biology strategy for high level production of O-acetylhomoserine in Escherichia coliPEP—phosphoenolpyruvate;PYR—pyruvate;OAA—oxaloacetate;ACE—acetate;HSE—L-homoserine;MetX—acetyltransferase

吲哚霉素是細菌色氨酸轉(zhuǎn)移RNA合成酶的競爭性抑制劑，對臨床耐藥菌具有很好的殺菌活性［46］。2019年，杜藝嶺教授課題組和加拿大Ryan教授課題組合作［47］，闡述了細菌代謝過程中的特異性趨同現(xiàn)象，并且通過對鏈霉菌和海洋來源的藤黃紫交替假單胞菌中吲哚霉素合成途徑的研究，整合了3種細菌合成酶構(gòu)建了一條人工合成途徑，使吲哚霉素效價提高了30%。

4.2 異源表達

由于天然產(chǎn)物生物合成過程中的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控，難以合理系統(tǒng)地設(shè)計和改造原宿主的合成途徑以提高天然產(chǎn)物的生物合成效率［48-49］。隨著基因組學的發(fā)展和合成生物學技術(shù)的日趨成熟，異源表達已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)生復(fù)雜天然產(chǎn)物。由于大量基因組序列的可獲得性和生物信息學理論及方法的發(fā)展，將生物合成活性分子的信息和能力從原宿主轉(zhuǎn)移到遺傳更友好的模式宿主能極大提高其生產(chǎn)能力和效率［50-51］，同時通過遺傳操作在宿主中沉默某些基因，也有利于發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物。劉天罡教授課題組［52］將多殺菌素（spinosad）的生物合成基因簇轉(zhuǎn)移至含有更多前體（乙酰輔酶A、UDP-葡萄糖等）以及輔因子（NADPH、SAM）的白色鏈霉菌S.albusJ1074中，實現(xiàn)了多殺菌素的異源表達。經(jīng)代謝組學及蛋白質(zhì)組學分析，將多殺菌素生物合成中的3個限速步驟——鼠李糖合成模塊和甲基轉(zhuǎn)移酶SpnI，forosamine生物合成模塊以及聚酮合酶基因spnE分別過表達，從而使多殺菌素產(chǎn)量逐步提高至1460μg/L，比出發(fā)菌提高了約1000倍。另外，黑色素（melanin）是一類具有較好理化性質(zhì)、較好生物活性的吲哚類或酚類分子色素的總稱［53-54］。采用生長最快的細菌——需鈉弧菌為宿主，可以異源合成黑色素。經(jīng)替換tac啟動子誘導表達酪氨酸酶，在IPTG誘導下，酪氨酸酶的表達量提高100倍。隨后，比較不同的培養(yǎng)條件，結(jié)果顯示在M9培養(yǎng)基中黑色素的生產(chǎn)速度達到420 mg/（g CDW·h），其效率高于已報道的數(shù)值［55］。

5 展望

自青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，天然產(chǎn)物及其衍生物在人類對抗各種疾病的艱難斗爭中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，為提高人類健康水平、延長壽命和社會經(jīng)濟發(fā)展做出了巨大貢獻。然而，隨著靶點和化合物兩方面的枯竭，新藥研發(fā)所需的時間越來越長、資金需求越來越大，資源利用及浪費也相應(yīng)增大。如何加速新藥研發(fā)的進程，是擺在學術(shù)界和工業(yè)界面前的巨大挑戰(zhàn)和難題。雖然天然產(chǎn)物在成藥性方面存在各種各樣的缺陷，鑒于其結(jié)構(gòu)和活性的多樣性，現(xiàn)在和將來很長一段時間內(nèi)仍將是新藥來源的一個重要方面?？梢灶A(yù)見的是，現(xiàn)代生物技術(shù)特別是合成生物學技術(shù)，在新型天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、活性天然分子的成藥性改良等方面將發(fā)揮不可替代的作用。在微生物天然產(chǎn)物領(lǐng)域，各種沉默基因簇的激活策略已經(jīng)帶來了不少結(jié)構(gòu)和活性新穎的天然產(chǎn)物，并且應(yīng)用合成生物學策略在改善成藥性方面也取得了一系列進展。在植物天然產(chǎn)物領(lǐng)域，雖然生物合成途徑的解析難度較大，但隨著多種組學技術(shù)的綜合應(yīng)用，傳統(tǒng)的提取分離研究模式正在快速向基于遺傳操作和生物合成途徑的方向轉(zhuǎn)移，并取得了可喜的進展。與此同時，以基因編輯為代表的新型分子生物學方法和手段發(fā)展迅猛，為合成生物學技術(shù)的完善和廣泛應(yīng)用提供了更多和更高效的工具。此外，計算機科學和信息學的快速發(fā)展也為其在合成生物學中的應(yīng)用注入了新的活力。生物信息學已經(jīng)成為合成生物學不可或缺的高效工具，人工智能也將逐步應(yīng)用于合成生物學的研究和開發(fā)中。這些發(fā)展均將有力推動天然產(chǎn)物成藥性的合成生物學改良。通過對天然活性分子結(jié)構(gòu)與活性的分析，理性設(shè)計和改造生物合成途徑，充分利用代謝工程方法改造和開發(fā)新型異源表達系統(tǒng)，進一步提高各種元件、模塊和底盤的適配性，快速構(gòu)建人工生物合成體系，必將大幅提升天然產(chǎn)物的成藥率，為臨床疾病治療提供新的手段，從而進一步展現(xiàn)合成生物學的潛能和生命力。