張?zhí)m蘭 于 洋 曹領(lǐng)改 魏德強(qiáng)

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

人妊娠相關(guān)血漿蛋白A(proteinase pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)是一種鋅結(jié)合金屬糖蛋白由胎盤分泌并直接進(jìn)入母體血液循環(huán)[1，2]。從胚泡著床期開(kāi)始，PAPP-A的濃度一直升高直至妊娠結(jié)束。PAPP-A是唐氏綜合征(down syndrome，DS)篩查的主要標(biāo)志物之一，應(yīng)在妊娠11～14周進(jìn)行定量篩查[3]。在妊娠期間，循環(huán)的PAPP-A通過(guò)二硫鍵結(jié)合嗜酸性主要堿性蛋白(proMBP)形成異源四聚體(2:2)，即PAPP-A/ProMBP，分子量約為500 kD，PAPP-A單體的分子量約為200 kD[4]。與PAPP-A一樣，proMBP在妊娠期間在胎盤中合成，但其在妊娠過(guò)程中的作用尚未闡明。

孕婦血清PAPP-A水平與不良妊娠結(jié)果有關(guān)，如妊娠糖尿病、子癇前期、胎兒染色體異常、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、低出生體重、死產(chǎn)和早產(chǎn)[5-11]；在心血管疾病方面，PAPP-A亦可作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定程度的標(biāo)志物[12,13]；研究發(fā)現(xiàn)，PAPP-A能夠特異性地切割3種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)[14,15]：IGFBP-2、IGFBP-4和IGFBP-5，其與細(xì)胞表面的糖胺聚糖緊密結(jié)合，在組織內(nèi)起促進(jìn)生長(zhǎng)的酶的作用，在靠近IGF受體的位置釋放具有生物活性的IGF，且其是一種依賴膠原蛋白的原癌基因，所以PAPP-A可能作為腫瘤標(biāo)志物或癌癥高差異表達(dá)的治療靶點(diǎn)[16-18]。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)顯示PAPP-A在多種癌癥中高表達(dá)，見(jiàn)圖1。

本研究通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)結(jié)合高通量篩選的方法獲得可分泌高親和性、高特異性、高效價(jià)及高產(chǎn)量的抗PAPP-A雜交瘤細(xì)胞株，為雙抗體夾心檢測(cè)PAPP-A化學(xué)發(fā)光試劑盒及膠體金試紙條的研制和開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良材料。同時(shí)通過(guò)對(duì)試劑盒分析性能的評(píng)估為 PAPP-A檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用及國(guó)產(chǎn)化奠

圖1 PAPP-A在不同類型癌癥中的轉(zhuǎn)錄水平(Oncomine)Fig.1 Transcription levels of PAPP-A in different types of cancers (Oncomine)

定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、無(wú)血清培養(yǎng)基MD6和羊抗鼠 IgG由東北林業(yè)大學(xué)大慶生命技術(shù)研究院提供；A/J小鼠，雄性，6～8周齡，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所；PAPP-A、AFP、PRL、hPL和HCG蛋白抗原均購(gòu)于美國(guó)Fitzgerald公司；弗氏佐劑 、紅細(xì)胞裂解液、PEG2000、HAT 、HT、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白A(protein A)、HRP、魯米諾試劑均購(gòu)于Sigma 公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維、聚酯纖維、吸水紙及背板購(gòu)于上海金標(biāo)公司；氯金酸、檸檬酸鈉及其他試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。BHP9504化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司；加樣儀、洗板機(jī)及酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)BioTEK公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物免疫 取PAPP-A抗原及少量脂蛋白與弗氏佐劑乳化，乳化完全后免疫A/J小鼠，抗原免疫量為25 μg/只，每隔2周進(jìn)行第2次和第3次免疫。第3次免疫后第8天取小鼠尾部血清，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，選擇效價(jià)在1∶10 000以上的小鼠無(wú)菌取脾進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.2細(xì)胞融合與篩選 取小鼠脾細(xì)胞采用PEG2000方法使其與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)，篩選出已融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10天后吸取細(xì)胞上清，ELISA法進(jìn)行篩選，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株做多次亞克隆獲得可穩(wěn)定分泌抗PAPP-A單抗的細(xì)胞株。

1.2.3mAb純化 將篩選得到的抗PAPP-A細(xì)胞株用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)轉(zhuǎn)瓶中90 %以上的細(xì)胞死亡后離心收取上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾，采用protein A親和層析方法進(jìn)行抗體純化，獲得抗PAPP-A單抗，透析濃縮，-20℃儲(chǔ)存。

1.2.4mAb鑒定 BCA法測(cè)定抗體濃度。SDS-PAGE測(cè)定抗體純度。采用過(guò)碘酸鈉法將抗體標(biāo)記HRP，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定針對(duì)同一抗原不同表位的特異性單抗。

1.2.5CLIA的建立及性能分析

1.2.5.1CLIA的建立 將1株抗 PAPP-A mAb包被到ELISA板制成固相抗體，將另1株夾心的抗 PAPP-A mAb標(biāo)記HRP制成酶標(biāo)抗體。①以質(zhì)控血清作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，按比例將適量的PAPP-A加入到基質(zhì)血清中，得到濃度分別為 0(S0)，100(S1)，1 000(S2)，2 500(S3)，5 000(S4)和10 000(S5)ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)品。②在包被抗體板中20 μl 加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、100 μl酶標(biāo)抗體，振蕩混勻，37℃溫育1 h。③洗板，加入適量魯米諾，避光反應(yīng)3 min后，測(cè)定各孔發(fā)光值(RLU)。④繪制PAPP-A濃度和對(duì)應(yīng)RLU值的雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6ICG制備及性能分析

1.2.6.1抗體膠體金標(biāo)記 ①在100 ml小燒杯中加入轉(zhuǎn)子與膠體金，旋起轉(zhuǎn)子，用0.1 mol/L K2CO3將膠體金pH調(diào)至8.0；②計(jì)算標(biāo)記用的抗體取量，以10 μg/ml計(jì)算。將標(biāo)記用的抗體用ddH2O稀釋至300 μl。將稀釋后的抗體緩慢加入到膠體金中。加入完成繼續(xù)攪拌2 min后，室溫避光靜置15 min；③使用10% BSA溶液，以1%的終濃度進(jìn)行封閉，緩慢加入10～15 min，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)攪拌2 min后，室溫避光靜置15 min；④將封閉后的膠體金溶液置入1.5 ml離心管中，以3 500 r/min、4℃離心10 min，取上清，棄去沉淀；⑤將上一步離心的上清置于新的離心管，以12 000 r/min、4℃離心20 min，取沉淀，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2試紙條制備及分析 ① 溶液配制及制墊：標(biāo)記后的沉淀(1 ml，未加BL液)用40 μl 金標(biāo)儲(chǔ)存液(BL液)復(fù)溶，再加入80 μl金標(biāo)工作液B和13.2 μl ddH2O混勻(金標(biāo)儲(chǔ)存液+金標(biāo)工作液B+ddH2O =10 μl+20 μl+3.3 μl)，膠體金最終用量為1.25%，金標(biāo)墊為玻璃纖維，將玻璃纖維剪裁成寬0.5cm長(zhǎng)條，截取所需長(zhǎng)度，放于托盤上，將配制好的溶液均勻加到金標(biāo)墊上30 μl/cm。②干燥:制好的膠金墊在37℃干燥2 h或者室溫干燥8 h。③將NC膜貼于背板上;④劃線: T線將包被抗體用PBS稀釋到所需濃度，在T線的位置均勻劃線C線羊抗鼠 IgG，PBS透析，每次劃線之前取抗體與 0.2 mol/L NaCl等體積混合，使NaCl的終濃度為0.1 mol/L，加入1.5 μl 0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至5.5，混勻后，在C線的位置均勻劃線，T線與C線間隔5 mm，每次實(shí)驗(yàn)保持一致：⑤貼在背板上的NC膜，在37℃干燥2 h或室溫干燥8 h。⑥干燥后的金標(biāo)墊、吸水紙以及樣品墊貼到背板的指定位置，并適當(dāng)壓好，手工剪制金標(biāo)試紙條。⑦測(cè)定試紙條的靈敏度及特異性靈敏度：用試紙條對(duì)PAPP-A(濃度為50、40、30、0 ng/ml)的血清樣本進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。特異性：用試紙條對(duì)PAPP-A(濃度為 100 ng/ml)、AFP(濃度為500 ng/ml)、PRL(濃度為20 ng/ml)、hPL(濃度為12 000 ng/ml)、HCG(濃度為2 000 U/ml)的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1雜交瘤細(xì)胞株的篩選 A/J小鼠尾部血清效價(jià)達(dá)到1∶10 000時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后，篩選到5株陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)且分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞亞克隆后，將這5株雜交瘤細(xì)胞分別命名為#13-2-2、#20-1-1、#21-1-1、#44-1-1和#53-2-1。將其擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清液，通過(guò)蛋白A純化后，即可獲得5株mAb。

2.2抗人PAPP-A mAb的鑒定

2.2.1抗體的純度鑒定 在Mr25 kD、50 kD處各有1條清晰條帶，正是輕鏈與重鏈的位置，其他位置無(wú)雜帶，說(shuō)明這5株抗人PAPP-A mAb的純度均在95%以上。#44-1-1 mAb輕重鏈分子量均比其他4株小，這是由于小鼠IgG分為4個(gè)亞型，不同亞型分子量有差異，見(jiàn)圖2。

2.2.2抗體的效價(jià)鑒定 mAb效價(jià)如下：#13-2-2為1.7×10-9g/ml，#20-1-1為3.3×10-9g/ml，#21-1-1為6.9×10-9g/ml，#44-1-1為4.0×10-9g/ml，#53-2-1為4.0×10-9g/ml，見(jiàn)圖3。

2.2.3抗體的表位鑒定 將#20-1-1抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記，使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)其余4株抗體與#20-1-1抗體是否競(jìng)爭(zhēng)，來(lái)判別4株抗體是否與#20-1-1抗體抗PAPP-A抗原同一表位(圖4)?？贵w#13-2-2、#21-1-1、#44-1-1、#53-2-1與#20-1-1均不競(jìng)爭(zhēng)，即抗不同的表位，可以進(jìn)行雙抗體夾心反應(yīng)。

2.3雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光體系的建立 根據(jù)PAPP-A化學(xué)發(fā)光試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的靈敏度不高于25 ng/ml，線性上限不低于2 500 ng/ml，相關(guān)系數(shù)r不低于0.990 0，選擇抗體#13-2-2包被與抗體#20-1-1標(biāo)記建立夾心體系，標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖5。

2.4化學(xué)發(fā)光試劑盒的分析性能評(píng)估

2.4.1準(zhǔn)確度 平均檢測(cè)濃度為1 850.24 ng/ml，回收率R為107.2%。

2.4.3線性 將高值樣本 10 000 ng /ml 按表1所示稀釋為7個(gè)濃度，將這7個(gè)濃度與稀釋比例用最小二乘法求得其線性相關(guān)系數(shù)r為0.996 6(表1)。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)抗人PAPP-A mAb純度Fig.2 SDS-PAGE to detect anti-human PAPP-A mAb purityNote:Protein Mr marker；2.#13-2-2 mAb；3.#20-1-1 mAb；4.#21-1-1 mAb；5.#44-1-1 mAb；6.#53-2-1 mAb.

圖3 間接ELISA法檢測(cè)抗人PAPP-A mAb的效價(jià)Fig.3 Indirect ELISA to detect anti-human PAPP-A mAb titer

2.4.4重復(fù)性 濃度為500 ng/ml(低值)和3 500 ng/ml(高值)的樣本其檢測(cè)結(jié)果的CV值分別為5.46%、9.52%(表2)。

2.4.5特異性 用PAPP-A雙抗體夾心試劑盒檢測(cè)樣本AFP、PRL、hPL和HCG，其檢測(cè)值均小于10 ng/ml(圖6)，因此認(rèn)為該試劑盒與以上4種物質(zhì)均不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5膠體金試紙條

2.5.1試紙條靈敏度 PAPP-A(濃度為50 ng/ml)陽(yáng)性樣本在試紙條的T線上出現(xiàn)清晰紅色條帶，所以此膠體金體系靈敏度不小于50 ng/ml，見(jiàn)圖7。

圖4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗人PAPP-A mAb表位Fig.4 Competition ELISA assay of anti-human PAPP-A mAb epitope

圖5 PAPP-A雙抗體夾心標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 PAPP-A double-antibody sandwich standard curve

表1 線性評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果

表2 試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性評(píng)估

圖6 PAPP-A雙抗體夾心特異性檢測(cè)Fig.6 PAPP-A specific detection of double-antibody sandwich

圖8 試紙條特異性Fig.8 Specificity of test stripNote:1.PAPP-A(100 ng/ml)；2.AFP(500 ng/ml)；3.PRL(20 ng/ml)；4.hPL(12 000 ng/ml)；5.HCG(2 000 ng/ml).

2.5.2試紙條特異性 PAPP-A陽(yáng)性血清在試紙條的T線上出現(xiàn)清晰紅色條帶，而AFP、PRL、hPL及HCG陽(yáng)性血清的T線上沒(méi)有出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明未發(fā)生交叉反應(yīng)，見(jiàn)圖8。

3 討論

PAPP-A由胎盤與蛻膜產(chǎn)生，在妊娠期間被大量釋放到孕婦的外周血中，其在受精卵著床、胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中均起重要作用。正常情況下，隨著妊娠的發(fā)展，孕婦體內(nèi)PAPP-A的水平不斷升高，但在唐氏綜合征胎兒孕婦體內(nèi)，妊娠早期PAPP-A的水平要明顯低于正常孕婦，至孕中期，PAPP-A水平與正常孕婦的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，美國(guó)的DS診斷指南始終將孕早期PAPP-A偏低作為DS的診斷指標(biāo)[21]。此外，血清PAPP-A 水平升高可以反映動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性，可以作為預(yù)測(cè)大動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的一種新的血清學(xué)指標(biāo)[22]。最近研究發(fā)現(xiàn)，多種癌癥中PAPP-A高表達(dá)，PAPP-A有望成為癌癥治療靶點(diǎn)或腫瘤標(biāo)志物。因此PAPP-A含量的檢測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前，PAPP-A的檢測(cè)方法主要是放射免疫法、ELISA法、時(shí)間分辨熒光免疫法及化學(xué)發(fā)光法。放射免疫法需要純化的PAPP-A作為標(biāo)準(zhǔn)和示蹤劑，但是純化PAPP-A的過(guò)程非常復(fù)雜，且碘會(huì)產(chǎn)生放射性污染。ELISA疫法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度及特異性不高，存在假陽(yáng)性。時(shí)間分辨熒光免疫法具有高靈敏度和較寬的線性范圍，但該方法中采用的是PAPP-A多克隆抗體，由于PAPP-A在血清中以復(fù)合物形式存在，因此存在交叉反應(yīng)，降低了檢測(cè)特異性。而化學(xué)發(fā)光法是一種以量度標(biāo)記物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光量為基礎(chǔ)的分析方法，其靈敏度高、特異性強(qiáng)、低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、線性范圍寬，被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的實(shí)驗(yàn)室診斷方法之一[23]。由于進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格昂貴，因此成功研制和生產(chǎn)PAPP-A定量測(cè)定化學(xué)發(fā)光試劑盒及膠體金試紙條具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

本研究采用雜交瘤細(xì)胞高通量篩選策略，獲得5株陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定分泌、高親和力、高特異性抗體與高產(chǎn)量的PAPP-A雜交瘤細(xì)胞株[20]。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，其上清采用protein A免疫親和純化，使所得單克隆抗體避免牛血清中免疫球蛋白的污染，純度達(dá)到95%以上。5株單抗效價(jià)均在1×10-8g/ml以上，為后續(xù)化學(xué)發(fā)光試劑盒及膠體金試紙條的研制提供了高質(zhì)量的原料，同時(shí)為提高試劑盒(條)的靈敏度奠定了基礎(chǔ)。

本研究建立的雙抗體夾心檢測(cè)PAPP-A的化學(xué)發(fā)光體系靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性和特異性均能達(dá)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。其中該體系在0～10 000 ng/ml的檢測(cè)范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(r≥0.990 0)；本研究所建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系與AFP、PRL、hPL和HCG等與PAPP-A相似的血清標(biāo)志物進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果表明，該體系與以上4種物質(zhì)均不發(fā)生交叉反應(yīng)，排除了血清中相關(guān)物質(zhì)的干擾，增加PAPP-A定量的準(zhǔn)確性。本研究開(kāi)發(fā)的膠體金試紙條具有成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度和特異性高、攜帶、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。