謝天飛 王凌云 劉 麗 桑建中

(河南醫(yī)學高等?？茖W校耳鼻咽喉科，鄭州 451191)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種惡性程度較高的頭頸部腫瘤，其中、晚期多采用放療輔以化療治療，但5年生存率依然不足50%[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是目前研究較多的一類參與腫瘤細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等進程的無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子[2]。肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1(actin filament associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)作為lncRNA的一員，通過改變肌動蛋白絲及微絲的完整性調(diào)控細胞的吞噬運動[3]。目前，針對AFAP1-AS1的研究表明，其在腫瘤中表達量明顯高于正常組織，表明AFAP1-AS1高表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，但其參與腫瘤相關進程的具體作用機制尚不清楚[4，5]。本研究通過短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾AFAP1-AS1并轉(zhuǎn)染人鼻咽癌HNE2細胞進行體外細胞與體內(nèi)裸鼠移植瘤試驗，探索AFAP1-AS1干擾對NPC的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 5周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠10只，體質(zhì)量(16.37±1.07)g，購自北京阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0009]，所有BALB/c裸鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2015-0035]。

1.1.2細胞來源 NPC細胞HNE2購自中國科學院上海細胞生物所。

1.1.3主要試劑 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；lncRNA AFAP1-AS1-shRNA、NC-shRNA購自上海吉凱基因技術有限公司；脂質(zhì)體、Lipofectamine?2000購自Thermo Fisher Scienti-fic；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth pactor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、β-actin抗體以及抗小鼠/兔IgG購自美國Santa Cruz公司；PCR試劑盒購自美國Promega公司；所有引物由上海生工合成。

1.1.4主要儀器 TDL-4臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；IX51倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RI-6000酶標分析儀(美國雷杜公司)；FACS Canto Ⅱ 流式細胞儀(美國BD公司)；Image Master VDS凝膠自動成像儀(瑞典Pharmacia公司)。

1.2方法

1.2.1細胞懸液的制備 NPC細胞HNE2培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素或鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，生理鹽水漂洗后，0.25%胰蛋白酶消化液處理2 min后棄除胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基洗脫細胞制成細胞懸液。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染實驗 將培養(yǎng)好的細胞懸液分為空白對照組(Control)、陰性對照組(shRNA-NC)與lncRNA AFAP1-AS1干擾組(sh-AFAP1-AS1)用于后續(xù)含有目的片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，參照試劑盒說明操作并采用Lipofectamine?2000將lncRNA AFAP1-AS1穩(wěn)定下調(diào)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于sh-AFAP1-AS1組細胞，含無義序列shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于shRNA-NC組細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性細胞，若發(fā)出綠色熒光則視為轉(zhuǎn)染陽性，收集細胞用于RT-PCR檢測各組細胞AFAP1-AS1表達水平。

1.2.3結(jié)晶紫染色檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的各組細胞懸液調(diào)整密度至1×104個/ml，接種于24孔板，100 μl/孔，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h后棄上層培養(yǎng)液，PBS清洗2次后加入0.25%結(jié)晶紫溶液，200 μl/孔，常溫下染色20 min后，棄去結(jié)晶紫溶液，PBS清洗24孔板，重復3次后進行風干處理，用20%甲醛溶液完全溶解，酶標儀(490 nm)定量分析。重復試驗3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞懸液密度調(diào)整為4×104個/ml，接種于6孔板、400 μl/孔，每組3個復孔，培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2遍，棄上清液，加入試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5 μl Annex-inV/FITC、10 μl PI混合，室溫避光孵育15 min，用于流式細胞儀檢測。CellQuest軟件分析計算細胞凋亡率。重復試驗3次。

1.2.5Transwell小室體外侵襲實驗 待鼠成纖維細胞NIH3T3生長至80%融合時，PBS清洗細胞，置于無胎牛血清的RPMI1640中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)過程中每100 ml培養(yǎng)瓶中加入6 ml無胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，取上清液備用。將Transwell小室置于24孔板，40 μl基質(zhì)膠(Matrigel)平鋪于小室濾膜，經(jīng)紫外線過夜消毒后，用少量無胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液浸潤上室。在上室中分別加入400 μl密度為2×105個/ml的各組細胞懸液，下室中添加600 μl的NIH3T3上清液。每組細胞設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，利用棉簽輕柔的擦去上層未穿膜的細胞和基質(zhì)膠，冰甲醛固定濾膜后染色。將濾膜剝離后正面朝下固定于載玻片，光學顯微鏡下隨機選擇5個高倍鏡(×400)視野，統(tǒng)計各視野的平均穿膜細胞數(shù)。重復試驗3次。

1.2.6Western blot檢測各組細胞中VEGF、MMP-9、PCAN蛋白表達水平 提取培養(yǎng)48 h的各組細胞總蛋白，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛處理過預處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人VEGF、MMP-9、PCAN、β-actin一抗(1∶500)4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進行統(tǒng)計學分析。重復試驗3次。

1.2.7重組質(zhì)粒對裸鼠移植瘤的作用 將裸鼠隨機分為Control組與sh-AFAP1-AS1組，每組5只。將目的質(zhì)粒與脂質(zhì)體(1∶3)混合，質(zhì)粒最終濃度為0.5 mg/ml，收集對數(shù)生長期的HNE2細胞，以1×108/ml 細胞懸液注射于裸鼠右腋下，Control組注射shRNA-NC，腫瘤直徑大于5 mm時則成為移植瘤標準，飼養(yǎng)2周后處死裸鼠，分離腫瘤并測定腫瘤質(zhì)量，并將一部分腫瘤組織置于4%甲醛溶液中固定，用于免疫組織觀察VEGF表達水平；另一部分腫瘤組織置于-80℃存儲，用于RT-PCR與Western blot檢測2組腫瘤組織中AFAP1-AS1表達水平。2組裸鼠試驗期間均在培育室飼養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度50%～55%，人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，裸鼠全天自由飲水與飲食。

1.2.8免疫組化與TUNEL法檢測細胞凋亡

1.2.8.1免疫組化法 將腫瘤組織進行常規(guī)石蠟切片，脫水、PBS溶液漂洗、3% H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原修復、PBS漂洗5 min、加入一抗37℃反應2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37℃反應40 min、PBS漂洗5 min、DAB室溫顯色20～30 min，鏡檢觀察有棕黃色顆粒出現(xiàn)時采用自來水終止。蘇木素復染30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光鏡下觀察細胞樣本中VEGF的陽性表達細胞，其細胞漿表現(xiàn)為棕黃色顆粒。每張標本選取視野10個(×400)，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)，以計算陽性細胞率，陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.8.2TUNEL法 取各組裸鼠移植瘤組織進行常規(guī)石蠟包埋，參考免疫組織化學試劑盒說明書操作，于顯微鏡下觀察并采集圖像。隨機選取5個視野，記錄200個細胞中陽性細胞數(shù)，細胞凋亡情況運用末端標記技術TUNEL法檢測并以TUNEL指數(shù)表示。細胞核呈棕黃色者視為凋亡細胞。

1.2.9RT-PCR檢測各組細胞中AFAP1-AS1相對表達水平 采用TRIzol試劑提取組織及細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR-Green PCR Mix 檢測mRNA表達水平。PCR參數(shù)設置：95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環(huán)。引物信息如下：GAPDH內(nèi)參基因，F(xiàn)：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，R：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；AFAP1-AS1，F(xiàn)：5′-ACTGAAGAGGAACCAGGGACAG-3′，R：5′-GGGGAAACTGAAATGAATGAAG-3′；應用qPCR和2-ΔΔCt法分析相關基因表達數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1AFAP1-AS1促進HNE2細胞增殖 RT-PCR結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組HNE2細胞中AFAP1-AS1表達水平顯著低于Control組(P<0.05)，而shRNA-NC組HNE2細胞中AFAP1-AS1表達量與Control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1A)；結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組HNE2細胞增殖率顯著低于Control組(P<0.05)，而shRNA-NC組HNE2細胞增殖率與Control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1B、C。

2.2AFAP1-AS1抑制HNE2細胞凋亡 FCM檢測結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組HNE2細胞凋亡率顯著高于Control組(P<0.05)，而shRNA-NC組HNE2細胞凋亡率與Control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3AFAP1-AS1促進HNE2細胞侵襲轉(zhuǎn)移 Transwell結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組HNE2細胞侵襲率顯著低于Control組(P<0.05)，而shRNA-NC組HNE2細胞侵襲率與Control差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3A；Western blot結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組HNE2細胞中VEGF、MMP-9蛋白水平顯著低于Control組(P<0.05)，而shRNA-NC組HNE2 細胞中VEGF、 MMP-9 蛋白含量與 Control 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3B。

圖1 AFAP1-AS1促進HNE2細胞增殖

圖2 AFAP1-AS1抑制HNE2細胞凋亡Fig.2 AFAP1-AS1 inhibits apoptosis of HNE2 cellsNote:Compared with Control,*.P<0.05.

圖3 AFAP1-AS1促進HNE2細胞侵襲(×400)

2.4AFAP1-AS1影響體內(nèi)HNE2腫瘤形成 將sh-FAP1-AS1組高濃度HNE2細胞懸液注入裸鼠右腋下以建立移植瘤模型，結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組裸鼠腫瘤中的AFAP1-AS1表達水平顯著低于Control組(P<0.05)， 見圖4A；sh-AFAP1-AS1組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著低于Control組(P<0.05)，見圖4B。sh-AFAP1-AS1組裸鼠腫瘤組織中的細胞凋亡率顯著高于Control組(P<0.05)，見圖5A；免疫組化檢測結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組裸鼠腫瘤組織中VEGF陽性表達率顯著低于Control組(P<0.05)，見圖5B。

圖4 AFAP1-AS1影響體內(nèi)HNE2腫瘤的形成

圖5 AFAP1-AS1對細胞凋亡率及VEGF蛋白的影響(×400)

3 討論

AFAP1是一類肌動纖維相關蛋白，能夠通過與肌動蛋白及 Src家族蛋白或其他通路蛋白結(jié)合， 改變微絲的完整性，調(diào)控細胞的吞噬運動，從而參與腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[6,7]。AFAP1-AS1作為AFAP1的反義鏈，是目前研究較多的一種lncRNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平對AFAP1進行調(diào)控，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[8]。雖然目前有很多關于AFAP1-AS1在腫瘤過程中的研究，但其具體作用機制尚不明確。課題組通過shRNA干擾AFAP1-AS1并轉(zhuǎn)染至NPC HNE2細胞系中發(fā)現(xiàn)，抑制AFAP1-AS1表達后，HNE2細胞的增殖及侵襲能力降低，凋亡增強，表明在NPC細胞中，AFAP1-AS1可能是作為促癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Luo等[9]檢測食管鱗狀細胞癌患者瘤組織中AFAP1-AS1表達發(fā)現(xiàn)，其表達量較正常組織顯著上調(diào)，AFAP1-AS1高表達量與腫瘤大小、臨床TNM顯著相關；體外實驗證實，AFAP1-AS1能夠促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖，AFAP1-AS1高表達患者總體生存率降低。Lu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1在肝癌組織中高表達，沉默AFAP1-AS1后，Ki-67、Bcl-2、MMP-9基因表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，表明AFAP1-AS1能夠抑制細胞凋亡。Zhang等[11]通過敲除肝癌細胞中AFAP1-AS1發(fā)現(xiàn)，RhoA和Rac2表達下調(diào)，提示AFAP1-AS1可能通過調(diào)控RhoA/Rac2家族蛋白通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。癌細胞的惡性增殖是其發(fā)展的重要基礎，而促癌基因通過促進細胞的增殖及分裂，從而加速腫瘤的發(fā)展，同時，促癌基因還會抑制細胞凋亡過程進一步促進腫瘤細胞發(fā)展[12,13]。本研究于既往研究結(jié)果相符，提示在上述惡性腫瘤中，AFAP1-AS1可能是作為一種促癌基因來調(diào)控腫瘤細胞增殖及凋亡過程。

浸潤和轉(zhuǎn)移是腫瘤的兩大惡性特征，腫瘤轉(zhuǎn)移受很多過程調(diào)控。VEGF能夠特異性的誘導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生分裂增生，還能夠增加血管的通透性，其功能的多樣性與下游的絡氨酸激酶受體種類相關[14]。腫瘤的生長離不開血管新生，腫瘤的血管功能及結(jié)構與正常血管不同，多半是畸形的，容易誘發(fā)局部組織缺氧，進一步刺激VEGF的合成，導致腫瘤細胞浸入血管進而向淋巴及遠處細胞侵襲轉(zhuǎn)移[15]。MMPs是間質(zhì)細胞的標志蛋白之一，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘發(fā)因素之一，MMP-9主要是通過降解細胞外基質(zhì)，從而使腫瘤細胞更容易轉(zhuǎn)移[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制AFAP1-AS1表達后VEGF和MMP-9蛋白表達均顯著降低，表明AFAP1-AS1除了通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控AFAP1蛋白相關途徑影響細胞運動外，還能通過增強血管通透性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程調(diào)控細胞侵襲。付叢等[18]分析表明，AFAP1-AS1能夠參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，可能是通過解除肌動蛋白纖維的完整性，增強腫瘤細胞的黏附遷移來完成腫瘤轉(zhuǎn)移。課題組結(jié)合既往研究結(jié)果推測AFAP1-AS1調(diào)控腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移可能的機制：一方面在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控AFAP1表達改變微絲完整性，讓細胞形態(tài)發(fā)生變化；另一方面通過調(diào)控VEGF和MMP-9表達，促進腫瘤細胞血管的生長和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改變血管的通透性同時使細胞去極化，為腫瘤細胞提供更容易轉(zhuǎn)移及浸潤的條件。

為了進一步研究AFAP1-AS1的功能，課題組利用裸鼠進行了異體移植實驗，結(jié)果顯示，抑制AFAP1-AS1表達后，腫瘤的質(zhì)量顯著降低，提示AFAP1-AS1能夠促進腫瘤生長，其機制可能是通過促進腫瘤組織中VEGF的表達來促進血管生成，從而促進腫瘤的生長。Bo等[19]通過cDNA芯片技術構建了lncRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1表達量在NPC組織中顯著升高，體外實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染sh-AFAP1-AS1后NPC細胞的侵襲和遷徙能力較明顯減弱，裸鼠異體實驗與體外實驗結(jié)果一致，表明AFAP1-AS1能夠促進NPC細胞的侵襲和遷徙。Ma等[20]通過研究AFAP1-AS1的表達發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1能夠下調(diào)Twist1和Vimentin表達，上調(diào)E-cadherin表達，抑制膽囊細胞的上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，抑制細胞的遷徙。與前人結(jié)果相一致，證實了AFAP1-AS1能夠促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，AFAP1-AS1能夠顯著促進NPC細胞增殖，抑制細胞凋亡，并通過促進VEGF和MMP-9蛋白表達促進NPC細胞的遷移和侵襲。進一步證實AFAP1-AS1可能作為NPC抗侵襲和轉(zhuǎn)移基因治療的潛在靶基因。