張建敏，楊康卓，劉 芳，何張?zhí)m，彭志云，鄭 佳，喬宗偉，趙 東

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007)

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程是一種多菌種參與的多邊反應(yīng)過程。來自曲藥、窖泥及發(fā)酵環(huán)境的多種微生物（細(xì)菌、酵母和霉菌）以酒醅為載體，在白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中進(jìn)行復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝，生成各類代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)。獨(dú)特的固態(tài)多微釀造工藝賦予了白酒豐富的呈香呈味物質(zhì)和健康活性功能成分[1-4]。近年來，對(duì)白酒微量成分研究結(jié)果表明，風(fēng)味成分的種類和含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過健康活性功能成分。已有報(bào)道中，在濃香型白酒中檢出了大量的呋喃類物質(zhì)（抗氧化、抗癌活性）、苯并呋喃類化合物（抗炎性）、糠醛（殺菌）等[4]，濃香型大曲中檢出了吡嗪類（抗氧化、抗癌）、萜烯類（抗癌、抗病毒、抗炎）等[5]。而微生物代謝產(chǎn)生萜烯等健康活性功能成分少有文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本研究試圖從濃香型白酒發(fā)酵酒醅中篩選出1 株具有特殊功能的酵母菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和26S rDNA 測(cè)序分析鑒定、頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC/MS）分析其菌體及代謝特征，以提高對(duì)酵母在發(fā)酵過程中的科學(xué)認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：五糧粉糖化液制備參考文獻(xiàn)[6]。

1.1.2 主要試劑與儀器

Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259(上海生工生物)；SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒SK8131(上海生工生物)；立式高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS）購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；生物安全柜（ESCO Class II），珠海市珠峰儀器儀表有限公司；固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS 纖維萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890B GC-5977B MSD）美國(guó)Agilent 公司；4-辛醇，GC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定

1.2.1.1 形態(tài)觀察試驗(yàn)

對(duì)平板劃線的單菌落進(jìn)行形態(tài)觀察以及顯微形態(tài)觀察。

1.2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

4)浙江省觀光采摘節(jié)慶在市級(jí)空間上具有數(shù)量上和質(zhì)量上的差異。寧波是各市的典范，金華和臺(tái)州數(shù)量和質(zhì)量也實(shí)現(xiàn)了協(xié)調(diào)發(fā)展，杭州、嘉興、湖州質(zhì)量上都要增強(qiáng)從而跟上數(shù)量的發(fā)展，溫州和紹興應(yīng)多開發(fā)觀光采摘節(jié)慶，衢州和舟山在數(shù)量和質(zhì)量上都有待提高。

DNA 提取：將菌株3-13 接入增殖培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d，取1 mL菌液10000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按生工生物真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)提取DNA，-20 ℃保藏備用。

PCR 擴(kuò)增：利用引物NL1 和NL4 對(duì)酵母菌基因組26S rDNA D1/D2 進(jìn)行擴(kuò)增，NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。擴(kuò)增體系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each) 1 μL，DNA 10 ng，引物F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃60 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

26S rDNA 序列測(cè)定：利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；純化產(chǎn)物的測(cè)序工作由上海生工生物有限公司完成。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[7-8]：將所測(cè)定的酵母菌26S rDNA 基因序列分別與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 分析，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近的標(biāo)準(zhǔn)菌株用Clustalw 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA 5 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵液風(fēng)味

1.2.2.1 菌株發(fā)酵液培養(yǎng)

將酵母菌株3-13 種子液接種于五糧粉液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

萃取頭的老化：各類型萃取頭在首次使用前均需要在熱條件下老化，老化程序參考Supelco 老化指南。

萃取條件：吸取適量發(fā)酵液于10000 r/min離心5 min，吸取過0.45 μm 膜的上清液1 mL 加入頂空瓶中，加入50 μL 4-辛醇（10 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)，置于60 ℃加熱振蕩器中平衡15 min，萃取頭吸附揮發(fā)性香氣成分45 min，隨后插入GC 進(jìn)樣口熱解析3 min，分析其中揮發(fā)性成分。

1.2.2.3 GC/MS分析條件

GC 條件：DB-Wax（30.0 m 長(zhǎng)×0.25 mm 內(nèi)徑×0.25 μm 膜厚，J&W，美國(guó)）毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，載氣He 流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。

MS 條件：EI 源，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.2.2.4 化合物鑒定與半定量分析

化合物鑒定采用參考文獻(xiàn)[9]所屬方法進(jìn)行化合物定性；單個(gè)化合物的相對(duì)含量采用其與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比進(jìn)行半定量分析，含量以mg/L表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察試驗(yàn)

經(jīng)觀察，菌株3-13 菌落呈蠟狀圓形，柔軟、光滑、濕潤(rùn)，平板散發(fā)有濃厚的酒精發(fā)酵氣味；顯微形態(tài)呈球形、橢圓形，大小為0.5～1.5 μm，出芽生殖。見圖1。

圖1 3-13菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株26S rDNA 序列與GenBank 上的其他26S rDNA 序列進(jìn)行Blast 分析，做進(jìn)化樹(圖2)比較結(jié)果顯示，菌株3-13 與Candida pseudohumilisAS 2.3956（FJ888526.1）相似性為99 %，將該菌鑒定為Candida pseudohumilis。

2.2 菌株3-13發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析

本研究利用HS-SPME法提取發(fā)酵液中的香氣成分，發(fā)酵液和空白對(duì)照組的色譜圖差異較明顯（圖3）。

圖2 3-13菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株3-13主要物質(zhì)總離子流圖

如表1 所示，在菌株發(fā)酵液中共鑒定并定量了20 種揮發(fā)性成分，其中酯類6 種、萜烯類4 種、芳香族類4 種、醛酮類2 種、醇類2 種、酸類1 種，總含量比例為芳香族類62.61 %、醇類27.52 %、酯類4.36 %、萜烯類2.79 %、酸類2.57 %、醛酮類0.17%。

芳香族類：苯乙醇（69.56 %）、苯酚（0.27 %）、苯甲醛（0.51 %）、2-苯乙酰酯（29.68 %）。芳香族化合物大多數(shù)具有典型的花香和甜香味，其中苯乙醇被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的主要香味成分之一；酚類物質(zhì)具有特殊氣味，其中苯酚在低濃度時(shí)表現(xiàn)為墨水氣味，也為白酒中重要的呈香呈味成分。

表1 揮發(fā)性成分含量及香氣特征

醇類：異戊醇（99.49 %）、3-甲硫基-1-丙醇（0.50%）。異戊醇是白酒中主要的醇類物質(zhì)，低濃度時(shí)具有典型的青草氣味。

酯類：己酸乙酯（51.58 %）、庚酸乙酯（6.30%）、辛酸乙酯（13.45%）、壬酸乙酯（7.84%）、癸酸乙酯（16.46 %）、棕櫚酸乙酯（4.36 %）均為直鏈飽和酯，呈現(xiàn)水果味，且大部分在濃香型白酒中已經(jīng)被檢出，其中己酸乙酯含量在總酯中比例為51.58%。己酸乙酯是濃香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)[1]，且該菌株產(chǎn)己酸乙酯，可以用于制造功能酵母強(qiáng)化曲提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯含量。

萜烯類：芳樟醇（13.61 %）、β-金合歡烯（7.87 % ）、γ-壬內(nèi)酯（4.99 % ）、橙花叔醇（73.60 %）。萜烯類化合物廣泛存在于植物中，以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單位倍數(shù)的烴類及其含氧衍生物，包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等。中藥材含有大量的萜烯類化合物，這類化合物具有抗癌性、抗病毒以及抗炎癥等活性[4]。在酒體中，這些萜烯類化合物不但具有潛在的生物活性成分的功能功效，而且還具有呈香呈味的作用。萜烯類化合物是我國(guó)白酒研究中新發(fā)現(xiàn)的一類化合物，在藥香型、濃香型、醬香型白酒中均有檢出[4]。而濃香型白酒中萜烯類化合物的來源于原料、曲藥等，而由菌株發(fā)酵產(chǎn)生萜烯類化合物少有報(bào)道，該菌株所產(chǎn)橙花叔醇含量占萜烯類量的73.60 %，具有一定的研究應(yīng)用價(jià)值。

醛酮類：壬醛（53.76%）、乙偶姻（47.42%），其中乙偶姻為白酒中健康因子四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[4]，四甲基吡嗪是從川芎中分離出來的一種活性成分，具有增加腦血管的血流量等功效。該菌株能代謝產(chǎn)生乙偶姻，對(duì)提高濃香型基酒中四甲基吡嗪的含量具有一定的積極作用。

3 結(jié)論

本研究從五糧液發(fā)酵酒醅中篩選出1 株產(chǎn)香酵母3-13，經(jīng)形態(tài)學(xué)和26S rDNA 測(cè)序分析鑒定該菌株為Candida pseudohumilis。利用HS-SPMEGC/MS 分析其于五糧粉液體培養(yǎng)基中的代謝風(fēng)味物質(zhì)，該菌株不僅代謝出濃香型酒主體香味成分己酸乙酯且同時(shí)代謝橙花叔醇、芳樟醇、金合歡烯等萜烯類健康活性功能成分。這對(duì)濃香型白酒強(qiáng)化發(fā)酵代謝健康活性功能成分、提高白酒健康價(jià)值、酵母強(qiáng)化制曲提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯含量提供一種新的菌株，也對(duì)假絲酵母在發(fā)酵過程中的作用有了新的認(rèn)識(shí)。