任宇哲 于宙 陳宏 楊澤一 楊祥正

[摘要] 目的 探討PCG治療哮喘的作用靶點及分子作用機制。 方法 將80只Wistar大鼠隨機分為Control組、Model組、平喘顆粒（PCG）組及地塞米松（DXMS）組，每組20只。聯(lián)合吸入卵白蛋白和氫氧化鋁制備哮喘模型大鼠，造模結束前5 d開始灌胃給予相應的藥物干預治療，每組根據(jù)成模情況取10只用于后續(xù)實驗。比較四組支氣管肺泡灌洗液（BALF）及血清嗜酸性粒細胞（EOS）計數(shù)，EOS陽離子蛋白（ECP）和活化趨化因子（Eotaxin）的表達;采用RT-PCR和Western blot檢測肺Notch、STAT信號通路相關蛋白及mRNA的表達。 結果 Model組BALF及血清EOS計數(shù)高于Control組（均P < 0.01）;PCG組BALF及血清EOS計數(shù)低于Model組（均P < 0.01）。Model組ECP及Eotaxin含量高于Control組（均P < 0.01）;PCG組ECP及Eotaxin含量低于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。Model組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表達高于Control組;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表達低于Control組（均P < 0.01）。PCG組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表達低于Model組;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表達高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。Model組P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表達高于Control組;P-STAT4蛋白及mRNA表達低于Control組（均P < 0.01）。PCG組P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表達低于Model，P-STAT4蛋白及mRNA表達高于Model組（均P < 0.01）。 結論 PCG通過調控Notch/STAT信號通路降低EOS含量治療哮喘。

[關鍵詞] 支氣管哮喘;Notch/STAT信號通路;平喘顆粒;嗜酸性粒細胞

[中圖分類號] R5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（a）-0022-06

Molecular mechanism of Pingchuan Granules regulated EOS for asthmatic based on Notch/STAT signaling pathway

REN Yuzhe1? ?YU Zhou1? ?CHEN Hong2? ?YANG Zeyi3? ?YANG Xiangzheng

1.Department of Pediatrics， Beijing University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Shenzhen? ?518100， China; 2.Ward 1， Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 3.School of Tradition Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic target and molecular mechanism of Pingchuan Granules in the treatment of asthma. Methods Eighty Wistar rats were randomly divided into Control group， Model group， Pingchuan Granule （PCG） group and Dexamethasone （DXMS） group， with 20 rats in each group. Asthma model rats were prepared by the method of combined inhalation of ovalbumin and aluminum hydroxide. Five days before the end of modeling， the corresponding drug intervention treatment was given by gavage. According to the modeling condition， ten of each group were selected for subsequent experiments. Bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and serum eosinophilic granulocyte （EOS） counts， EOS cationic protein （ECP） and activated chemokine expression （Eotaxin） were compared among the four groups. Expression of proteins and mRNA related to Notch and STAT signaling pathways in lung were measured by RT-PCR and Western blot. Results BALF and serum EOS counts in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， BALF and serum EOS counts in PCG group were lower than those in Model group （all P < 0.01）. The content of ECP and Eotaxin in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， and the content of ECP and eotaxin in PCG were lower than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in Model group were higher than those in Control group， and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in PCG group were lower than those in Model group and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were higher than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression of P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in Model group were higher than those in Control group， and P-STAT4 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. The expression P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in PCG group were lower than those in Model group， and P-STAT4 protein and mRNA were higher than those in Model group （all P < 0.01）. Conclusion PCG can reduce EOS by regulating Notch/STAT signaling pathway in the treatment of asthma.

[Key words] Bronchial asthma; Notch/STAT signaling pathway; Pingchuan Granules; Eosinophil

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病和氣道高反應性為特征的異質性疾病，主要炎癥成分為嗜酸性粒細胞（EOS）[1-2]。動物實驗顯示[3]，EOS浸潤與氣道反應性的增加顯著相關，并繼續(xù)在肺中積累和激活。研究報道稱信號轉導和轉錄激活因子（STAT）家族、Notch信號通路在哮喘的發(fā)病中與EOS的分化及增殖也密切相關[4-5]。目前其常用治療為免疫抑制治療，如激動劑、糖皮質激素、抗組胺藥、基因治療等[6]。盡管哮喘的治療已取得了一些進展，但仍缺乏有效且副作用小的藥物。

哮喘在中醫(yī)歸為“哮證”，以“發(fā)時治標，平時治本”為主要治則[7]。本課題組多年來致力于研究組方平喘顆粒（PCG），通過研究發(fā)現(xiàn)其在治療肺功能方面臨床效果顯著。前期動物實驗結果證實其具有平喘、鎮(zhèn)咳、化痰等作用，但是關于PCG否通過調控Notch/STAT信號通路發(fā)揮作用有待進一步探究。

因此本研究通過建立哮喘動物模型以及細胞實驗探究PCG對哮喘的改善作用，并進一步探討其是否通過調控Notch/STAT信號通路影響EOS的分子機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠80只，雄性，8周齡，體重（200±20）g，購買于北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證：11400700256012，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件：室溫22～26℃，相對濕度50%～70%，保持通風良好，黑白交替各12 h，自由攝食飲水，動物實驗過程遵循“3R原則”以及人道關懷。

1.2 主要儀器與試劑

定量PCR儀（SimpliAmp，賽默飛）;全自動血液分析儀（HM，美國庫克曼庫爾股份有限公司）;PCR擴增儀（ATC，賽默飛）;Bio-Rad電泳儀（PowerPac系列，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）。

卵清白蛋白（Sigma，O1641）;IgE酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma，RAB0799）;ECP酶聯(lián)免疫試劑盒[齊一生物科技（上海），QY-R2220]、Eotaxin酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma，RAB0043）;烏拉坦（武漢宏信康精細化工，51-79-6）;逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（Roche，11732650001）。PCG由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供（黑龍江中醫(yī)藥大學制劑室，150207），由淫羊藿15 g、黃芪10 g、款冬花12 g、炙麻黃10 g、太子參10 g、罌粟殼4 g、五味子10 g、知母10 g、地龍10 g組成。將其制備成每千克含91 g生藥的顆粒，經(jīng)換算大鼠的給藥劑量為10 mL/kg。地塞米松磷酸鈉注射液（DXMS，國藥集團容生制藥有限公司，1 mL：5 mg，11030022）。

1.3 實驗分組與處理

1.3.1 哮喘模型的建立? Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，在實驗的第0、12天，每只大鼠腹腔注射1 mg卵白蛋白（OVA）和100 mg氫氧化鋁凝膠無菌耐濃縮液（1 mL）致敏，并用5% OVA連續(xù)刺激5 d，每次30 min，1次/d，5 d后隔天激發(fā)1次，刺激6周，建立慢性哮喘模型，成模率>90%，對照組腹腔注射相應體積的10% OVA溶液。

1.3.2 分組及給藥? 80只大鼠隨機分為Control組、Model組、PCG組（5.4 g/kg）、DXMS組（1 mg/kg），每組20只。在造模結束前5 d開始給藥，PCG組和DXMS組給予相應藥物，Control組和Model組給予等量的蒸餾水，激發(fā)時在激發(fā)前1 h給予相應藥物，1次/d。同時，每天觀察動物的基本體征。造模給藥結束后，每組根據(jù)成模情況取10只用于后續(xù)實驗。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 實驗動物取材? 實驗結束后，從腹主動脈收集血液，并將其放入乙二胺四乙酸抗凝管中。分離頸部血管和神經(jīng)，暴露氣管，切1個小V形開口，并進行氣管插管。將右肺結扎，5 mL預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗左支氣管，收集支氣管肺泡灌洗溶液（BALF）。取肺組織，右肺上葉用4%多聚甲醛固定。液氮迅速冷凍右肺下葉組織以備使用。

組織勻漿：準確稱取適量右肺下葉組織，加入9倍體積的緩沖溶液或氯化鈉溶液于低溫冷藏，后加1 mg/L蛋白酶抑制劑或50 U/mL抑肽酶，制成10%組織勻漿液（W/V），3000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm）。沉淀用于提取組織蛋白，上清液用于檢測各種生化指標。

1.4.2 生理狀態(tài)觀察? 根據(jù)體重調節(jié)大鼠的給藥劑量，稱重1次/3 d。同時，觀察大鼠在刺激或致敏過程中的生理變化，如呼吸頻率和精神狀態(tài)等。

1.4.3 BALF及血清EOS計數(shù)? BALF以2000 r/min離心5 min（半徑10 cm），棄去上清液，沉淀物稀釋并重懸于1 mL預冷PBS中?；旌峡鼓苤械难?，放置20 min。通過自動五分類血液分析儀檢測BALF及血清EOS計數(shù)。

1.4.4 血清EOS活化標志物檢測? 根據(jù)試劑盒說明書，對四組血清EOS活化標志物陽離子蛋白（ECP）、趨化因子（Eotaxin）進行檢測。

1.4.5 BALF中EOS細胞的分離與培養(yǎng)? 四組BALF液經(jīng)處理獲得EOS細胞。將分離和純化的EOS細胞在含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細胞濃度調節(jié)至2×105個/孔，添加10 U/mL白細胞介素-5，并置于培養(yǎng)板上，在5%CO2和37℃條件下進行培養(yǎng)。

1.4.6 EOS細胞的鑒定（Wright-Giemsa染色）? 首先漿細胞涂片于撥片上、自然干燥;滴加瑞氏染液染1 min;加等體積的PBS（pH=6.4）混勻后室溫靜置5～10 min;水洗、干燥、鏡檢。

1.4.7 肺組織Notch、STAT信號通路相關蛋白表達的檢測? 稱取肺組織進行研磨、離心得到蛋白上清液，BCA試劑盒檢測組織總蛋白含量，加入loading上樣緩沖液和裂解液進行定量，100℃水浴15 min。通過制膠、上樣、電泳、轉膜、封閉等操作后，一抗孵育過夜，二抗孵育，最后放置于化學發(fā)光成像儀曝光成像，檢測Notch、STAT信號通路相關蛋白表達。

1.4.8 肺組織Notch、STAT信號通路相關mRNA表達的檢測? 取肺組織50 mg，勻漿后Trizol試劑提取總RNA，測其濃度和純度。采用RT-PCR逆轉錄試劑盒獲取cDNA，反應體系：1 μL Oligo（dT）18（0.5 μg/mL），10 μL 2×TS Reaction Mix TS Enzyme Mix，1 μL DNA 酶，20 μL RNase-free water至總體積為32 μL。根據(jù)試劑盒說明書操作進行擴增，對Notch、STAT和GAPDH基因進行引物序列設計，引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司（北京公司）合成，引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組一般行為學變化

Control組大鼠表現(xiàn)為亮發(fā)，活動正常，規(guī)律攝食攝水，正常呼吸頻率，抓握時迅速逃脫;Model組大鼠進食減少，頭發(fā)直立，稀疏干燥，呼吸急促常伴有喘息，呼吸頻率增加，多數(shù)有咳嗽現(xiàn)象，腹部肌肉抽搐和煩躁不安。與Model組比較，DXMS、PCG組大鼠飲食增加，活動更容易移動，呼吸和喘息頻率降低，毛發(fā)光澤，偶爾咳嗽，哮喘癥狀減輕。

2.2 四組BALF及血清EOS計數(shù)比較

Model組BALF及血清EOS計數(shù)高于Control組（均P < 0.01）;PCG組BALF及血清EOS計數(shù)低于Model組（均P < 0.01）。見表2。

2.3 四組ECP及Eotaxin含量比較

Model組ECP及Eotaxin含量高于Control組（均P < 0.01）;PCG組ECP及Eotaxin含量低于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.4 EOS形態(tài)鑒定

細胞著色均勻分布，細胞形態(tài)一致且均呈粉紅色圓形，Wright-Giemsa染色呈陽性，提示分離所得細胞為EOS細胞，純度檢測顯示其純度均>95%。見圖1（封四）。

2.5 四組Notch信號通路蛋白表達比較

Model組Notch1、2、4，Hes，Jagged1、2，Delta4蛋白表達高于Control組;Notch3，Delta1、3蛋白表達低于Control組（均P < 0.01）。PCG組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白表達低于Model組;Notch3，Delta1、3蛋白表達高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2。

2.6 四組STAT信號通路蛋白表達比較

Model組P-STAT1、3、5、6蛋白表達高于Control組，P-STAT4蛋白表達低于Control組（均P < 0.01）;PCG組P-STAT1、3、5、6蛋白表達低于Model組，P-STAT4蛋白表達高于Model組（均P < 0.01）。見圖3。

2.7 四組Notch信號通路mRNA表達比較

Model組Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表達高于Control組，Notch3，Delta1、3 mRNA表達低于Control組（均P < 0.01）;PCG組Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表達低于Model組，Notch3，Delta1、3 mRNA表達高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖4。

2.8 四組STAT信號通路mRNA表達比較

Model組P-STAT1、3、5、6 mRNA表達高于Control組，P-STAT4 mRNA表達低于Control組（均P < 0.01）;PCG組P-STAT1、3、5、6 mRNA表達低于Model組，P-STAT4 mRNA表達高于Model組（均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

哮喘是一種有EOS、肥大細胞、淋巴細胞等多種細胞參與的炎癥性疾病，EOS在其中發(fā)揮關鍵作用[8-9]。本研究應用OVA與氫氧化鋁聯(lián)合吸入法建立哮喘大鼠模型，探究PCG對哮喘的治療作用?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，哮喘模型中EOS在BALF[10-11]、肺部[12]、外周血液[13]表達均升高，且EOS脫顆粒產(chǎn)物ECP、活化刺激物Eotaxin在氣道平滑肌、肺組織和血清表達升高[14-17]。本研究制備哮喘模型的肺組織和支氣管中出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、EOS過表達、氣道重塑和肺組織損傷，提示IgE介導的哮喘模型復制成功[18-20]。本研究結果顯示，PCG組BALF及血清EOS計數(shù)、ECP和Eotaxin顯著下降（P < 0.05），推測PCG能夠通過抑制EOS達到治療支氣管哮喘的目的。

支氣管哮喘是由IgE介導的一種變態(tài)反應性氣道炎癥，EOS為其主要效應細胞，而Notch信號通路可以調節(jié)EOS的遷移和分化，由此推斷Notch信號通路與哮喘的發(fā)生存在一定的關聯(lián)[21-22]。賴天文等[23]研究結果顯示，哮喘模型鼠中Notch及其配體顯著增加，且Notch的靶基因Hes mRNA在血清及BALF中均顯著性上調。本研究結果顯示，PCG通過回調Notch信號通路Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes的表達，改善肺組織和氣道炎癥以及氣道重塑。實際是通過改善肺部EOS中Notch信號通路的表達，即PCG的靶細胞為EOS，其調控的相關的靶點為Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes。因此推斷PCG對哮喘模型中的EOS有調節(jié)作用，作用機制與Notch有關。

研究發(fā)現(xiàn)[24-25]，哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)EOS中存在STAT家族表達。阻斷STAT信號通路的表達可抑制EOS細胞的趨化和黏附，從而抑制呼吸道EOS浸潤控制哮喘發(fā)生[26-27]。本研究結果顯示，PCG對STAT1、3、4、5、6蛋白和mRNA的表達均有顯著改善作用，提示PCG通過上調P-STST4蛋白和mRNA的表達，下調P-STAT1、3、5、6蛋白和mRNA的表達實現(xiàn)對氣道重塑和炎癥的調控作用，即PCG通過調控肺組織STAT活性從而發(fā)揮改善哮喘的作用。因此推測PCG對哮喘模型中的EOS有調節(jié)作用，作用機制與STAT有關。

總之，PCG可通過減少EOS的數(shù)量，調節(jié)EOS的Notch和STAT信號通路中的許多環(huán)節(jié)從而改善超敏和炎癥反應，并抑制氣道重塑，從而達到改善大鼠哮喘模型的哮喘特征。

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（收稿日期：2020-04-17）