戴研平 高曉勤 丁賢勝

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；3.岳陽(yáng)市岳陽(yáng)樓區(qū)人民醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 414000；4.六盤(pán)水市人民醫(yī)院，貴州 六盤(pán)水 553000

鹽酸利多卡因（lidocaine hydrochloric acid，LHA）注射液是一種酰胺類(lèi)中效局麻藥及抗心律失常藥，近年來(lái)對(duì)利多卡因體外作用的報(bào)道較多，研究證實(shí)該藥可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1］。目前，具有高分辨率的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和掃描電鏡（search engine marketing，SEM）在科學(xué)研究中的應(yīng)用已經(jīng)日趨廣泛，透射電鏡具有高分辨率、高放大倍數(shù)和高性能的優(yōu)勢(shì)［2］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，LHA體外作用下，掃描電鏡觀察到精子頭、頸、尾部均出現(xiàn)不同程度的超微結(jié)構(gòu)的改變［3］。本研究通過(guò)探討LHA體外對(duì)人精子功能及透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步闡明精子功能改變的具體機(jī)制，為人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的開(kāi)展及男性不育的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016～2017年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心健康青年男性自愿獻(xiàn)精者8例，年齡 23～32，平均（26.8±1.8）歲，已正常生育一或兩個(gè)子女，禁欲3～7天后，手淫取得精液標(biāo)本，進(jìn)行精液常規(guī)分析，結(jié)果都符合世界衛(wèi)生組織規(guī)定的正常標(biāo)準(zhǔn)［4］。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑及儀器 20mg/mL鹽酸利多卡因（常州康普藥業(yè)有限公司，10mL/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022122）；1%鋨酸（北京化工廠）；3%戊二醛（北京化工廠）；醋酸鈾（上海瑞誠(chéng)化工有限公司）；Epon812環(huán)氧樹(shù)脂（沈陽(yáng)市強(qiáng)華試劑廠）；H-7650透射電鏡（日立）；計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）；SPX-150C恒溫恒濕箱（天津?qū)嶒?yàn)儀器廠）LKBII超薄切片機(jī)（湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）；HITCH E-1010離子濺射儀（日本日立公司）。

1.3 方法 收集精液標(biāo)本，待完全液化后隨機(jī)分為三組，分別為對(duì)照組、LHA低濃度組、LHA高濃度組。鹽酸利多卡因溶液的配置：取1mL精液不加LHA為對(duì)照組，低濃度組、高濃度組分別將0.25mL、0.75mL LHA與適量精液體外共同孵育，使LHA終濃度為5mg/mL、15mg/mL，總體積為1mL。輕輕混勻后，將各組精液標(biāo)本分別于37℃恒溫恒濕箱中孵育1h、2h后取出，用PBS液洗滌3次并離心（2000rpm），每次10min；取1～2滴精液標(biāo)本，3%戊二醛固定3h；PBS洗15min×3次，1%鋨酸固定2h；PBS洗15min×3次；丙酮梯度脫水（30%、50%、70%、90%）各1次×10min，100%3 次×10min；Epon812環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、聚合；超薄切片機(jī)切片；醋酸鈾染色30min；檸檬酸鉛染色10min；H-7650透射電鏡（日立）觀察精子超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.4 觀察指標(biāo) （1）正常精子頭部形態(tài)：頂體為雙層膜性結(jié)構(gòu)，呈平行貼于核表面，雙層頂體膜間為低電子密度，核染色質(zhì)較均勻；（2）正常精子尾部形態(tài)：頸部和尾部結(jié)構(gòu)完整，尾部自然彎曲，其中央纖維鞘呈平行排列，可見(jiàn)微管“9+2”結(jié)構(gòu)；（3）精子頂體完整狀況、頸部線(xiàn)粒體鞘腫脹情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LHA對(duì)精子功能的影響 LHA對(duì)各組精子功能產(chǎn)生影響，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)和LHA劑量的增加，改變?cè)矫黠@，主要表現(xiàn)在精子頂體部、頸部異常，精子畸形率和頸部腫脹率呈升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，低濃度組體外孵育1h、2h后精子結(jié)構(gòu)改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高濃度組體外孵育 1h、2h 后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 LHA體外與精子孵育后透射電鏡檢測(cè)結(jié)果（%，±s）

表1 LHA體外與精子孵育后透射電鏡檢測(cè)結(jié)果（%，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別 n 時(shí)間（h） 頂體畸形率 頸部腫脹率對(duì)照組 8 1 8.69±3.56 5.45±4.65 8 2 10.23±3.82 6.36±5.35低濃度組 8 1 23.44±3.8* 9.56±5.39*8 2 25.64±5.63* 15.68±5.68*高濃度組 8 1 48.69±8.36* 41.95±5.49*8 2 55.36±7.69* 52.31±8.69*

2.2 LHA對(duì)精子透射電鏡檢查結(jié)果 透射電鏡觀察低濃度組頂體少部為輕微波浪狀，大部為雙層膜性結(jié)構(gòu)，呈平行貼于核表面，雙層頂體膜間為低電子密度，核染色質(zhì)較均勻，頸部和尾部結(jié)構(gòu)完整，尾部自然彎曲，其中央纖維鞘呈平行排列，可見(jiàn)微管“9+2”結(jié)構(gòu)。高濃度組頂體與核分離，呈波浪狀，胞膜腫脹；頸部腫局部斷裂。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，精子超微結(jié)構(gòu)改變?cè)矫黠@，表現(xiàn)在精子頂體部、頸部異常。LHA體外與精子孵育后透射電鏡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 LHA對(duì)精子透射電鏡的影響（TEM×15000倍）

3 討論

電子顯微鏡是目前了解精子形態(tài)的最客觀最有效工具，其分辨率超高［5］。由于透射電鏡的高分辨率，能夠觀察到精子的胞膜、頂體、胞核、頸體部等結(jié)構(gòu)。精子可分為頭、尾兩部分，頭部有一個(gè)高度濃縮的細(xì)胞核，核的前2/3有頂體，尾部又分為頸段、中段、主段和末端四部分。頂體是一種特殊的溶酶體，內(nèi)含多種水解酶，如頂體酶、透明質(zhì)酸酶等，在受精過(guò)程中發(fā)揮重要作用。常規(guī)精液分析一直是評(píng)價(jià)男性生育力的診斷標(biāo)準(zhǔn)，精子形態(tài)、活動(dòng)率是受精過(guò)程中重的參數(shù)之一，與頂體內(nèi)酶系關(guān)系十分密切［6］。本課題組前期研究結(jié)果表明，精子頂體內(nèi)頂體蛋白酶（ACE）、透明質(zhì)酸酶（HYD）活性的檢測(cè)可作為一種有效的判斷生育力的檢測(cè)指標(biāo)［7-10］，冷凍及精漿中系列酶與男性不育之間存在密切關(guān)系［11-16］。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組孵育1 h、2h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與本課題組前期掃描電鏡下的結(jié)果相似。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組精子頂體畸形率和頸部腫脹率較高，且隨著LHA終濃度的增高和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，精子頂體畸形率和頸部腫脹率呈明顯上升趨勢(shì)。

本研究透射電鏡觀察下，可見(jiàn)胞膜受損，頂體與核分離，核內(nèi)空泡出現(xiàn)。本課題組前期掃描電鏡下觀察到隨著LHA終濃度的增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，精子頭部變扁甚至出現(xiàn)凹陷，本研究進(jìn)一步證實(shí)可能是，其原因可能是：LAH體外作用使精子頂體超微結(jié)構(gòu)改變，胞膜受損，主要表現(xiàn)為頂體內(nèi)外膜分離，導(dǎo)致頂體內(nèi)容物丟失或頂體膜上結(jié)合的透明質(zhì)酸酶等活性降低所致。

總之，LHA能夠?qū)蛹捌涑⒔Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且隨著LHA終濃度的增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，精子超微結(jié)構(gòu)改變?cè)絹?lái)越明顯，可能是導(dǎo)致人類(lèi)輔助生殖技術(shù)成功率低的原因之一，但LHA能否改變精子基因結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致精子后續(xù)一系列結(jié)構(gòu)及功能變化，有待本課題組后續(xù)進(jìn)一步研究。