張銳虎 王晨陽 王 璐 余婧婧 王文桃 陳朝陽

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,太原 030001)(2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001)

中國(guó)地鼠(Chinese hamster)又名黑線倉鼠,是原產(chǎn)于我國(guó)的特色實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源,在遺傳學(xué)、傳染病、糖尿病、腫瘤等方面的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-4]。隨著生命科學(xué)的發(fā)展,標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、相關(guān)制品的安全性密切相關(guān),已成為生命科學(xué)研究發(fā)展的基礎(chǔ)和重要支撐條件[5]。本研究利用剖宮產(chǎn)獲得的仔鼠,通過由清潔級(jí)ICR小鼠代乳的方式對(duì)中國(guó)地鼠進(jìn)行了生物凈化,經(jīng)微生物、寄生蟲檢測(cè)達(dá)到了清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn),為中國(guó)地鼠的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)中國(guó)地鼠、清潔級(jí)ICR小鼠均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(晉)2015-0001。飼養(yǎng)在溫度為(22±2)℃,相對(duì)濕度為40%～70%,光照時(shí)間為12 h/12 h(光暗交替)的環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(晉)2015-0001,自由攝食飲水。整個(gè)飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照3R原則的相關(guān)要求對(duì)待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理審批號(hào)為SYDL2019011。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰),恒溫加熱板(其林貝爾),電子秤,剖宮產(chǎn)用手術(shù)器械及燒杯、紗布、濾紙等。試劑:2%過氧乙酸,75%酒精,無菌蒸餾水,黃體酮(源葉生物)。

鼠料為實(shí)驗(yàn)地鼠繁殖飼料和大、小鼠繁殖飼料,由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供[蘇飼證(2014)01008];國(guó)產(chǎn)佳貝艾特 kabrita嬰兒羊奶粉、蛋黃粉(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 中國(guó)地鼠預(yù)產(chǎn)期的判斷:成年地鼠單籠飼養(yǎng),每天上午將發(fā)情雌鼠放入雄鼠籠中同籠2 h左右,檢查有陰栓時(shí)視為交配成功。第12天開始檢查發(fā)現(xiàn)陰道口緊閉且有黑色血斑者即可判定妊娠。中國(guó)地鼠妊娠期為19～21 d,多在第20天凌晨分娩,于是在交配后第19天晚間肌肉注射3 mg黃體酮,次日上午進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)。

1.3.2 代乳鼠的選擇:選擇母性好、后代生長(zhǎng)發(fā)育良好,4～6月齡,并且于供體鼠剖宮前 1～2 d生產(chǎn)的經(jīng)產(chǎn)ICR小鼠作為代乳鼠。

1.3.3 剖宮產(chǎn)術(shù):手術(shù)器械和燒杯、紗布、濾紙等高溫滅菌后連同恒溫解剖板等一并放入超凈工作臺(tái),75%酒精及37℃的2%過氧乙酸溶液和無菌蒸餾水備用。

頸椎脫臼處死孕鼠,迅速浸入盛有過氧乙酸溶液的燒杯中5 s,75%酒精噴霧消毒燒杯后傳入超凈工作臺(tái)。無菌蒸餾水涮洗地鼠后,置于鋪有滅菌濾紙的37℃ 恒溫解剖板上,75%酒精消毒腹部,開腹充分暴露子宮。3把止血鉗分別夾住子宮頸及兩側(cè)的子宮角,分離整個(gè)子宮,迅速浸入過氧乙酸中浸泡3 s,蒸餾水沖洗,于滅菌紗布上小心撕破子宮露出幼鼠,剪斷臍帶剝離胎盤,用紗布擦凈幼仔身上特別是口鼻處的黏液和羊水并按摩,使仔鼠呼吸順暢并發(fā)聲,體色泛紅后迅速轉(zhuǎn)入代乳母鼠的IVC籠盒中進(jìn)行代乳。剖宮產(chǎn)手術(shù)在5 min內(nèi)完成。

1.3.4 代乳:代乳鼠飼養(yǎng)于IVC系統(tǒng)中,代乳前一天更換籠盒和墊料,鋪上滅菌的玉米芯和楊木刨花。染味時(shí)先將母鼠移出,每個(gè)鼠籠中放入2～3只剖宮產(chǎn)仔鼠,與仔鼠、墊料充分混合后移出部分原窩仔鼠,使仔鼠總數(shù)不超過6只,放入代乳母鼠進(jìn)行代乳,30日齡離乳。代乳期間定時(shí)稱體質(zhì)量,15日齡前每天按摩仔鼠腹部,以促進(jìn)消化、排便;環(huán)境溫度保持22～26℃,相對(duì)濕度40%～70%。

人工乳按蛋黃粉(g)∶羊奶粉(g)∶無菌蒸餾水(mL)=1∶5∶25的比例配制,根據(jù)供體鼠自交配成功起每天上、下午各一次;代乳鼠懷孕后每天上午一次,從分娩至代乳結(jié)束每天上、下午各一次的方案進(jìn)行添加。輔料為人工乳與適量地鼠繁殖飼料粉末拌勻后,揉搓成棒狀,放置于籠盒底部的盛料臺(tái)上,從仔鼠10日齡開始每天上、下午各添加一次。每次添加人工乳和輔料時(shí)棄去上次殘留,每天更換一次奶缽和盛料臺(tái)。

1.3.5 記錄代乳仔鼠生長(zhǎng)曲線與存活率:記錄0～30日齡代乳仔鼠的存活情況、體質(zhì)量變化趨勢(shì),繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 繪制自然分娩與代乳地鼠仔鼠的生長(zhǎng)曲線:隨機(jī)選擇100只自然分娩的中國(guó)地鼠仔鼠,記錄0～30日齡仔鼠體質(zhì)量變化,與ICR小鼠代乳的仔鼠進(jìn)行比較。

1.3.7 微生物、寄生蟲質(zhì)量檢測(cè):仔鼠離乳后,從不同窩中隨機(jī)選取6只中國(guó)地鼠仔鼠進(jìn)行微生物、寄生蟲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),結(jié)果以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)地鼠仔鼠的生長(zhǎng)曲線和存活率

ICR小鼠代乳的中國(guó)地鼠仔鼠體質(zhì)量均隨著日齡的增長(zhǎng)而增加,7日齡前雌、雄仔鼠體質(zhì)量基本相同,10日齡開始雌性仔鼠的體質(zhì)量明顯高于雄性仔鼠(P＜0.01,P＜0.001),所有仔鼠在14日齡開始體質(zhì)量迅速增長(zhǎng)(圖1A)。比較代乳與自然分娩的中國(guó)地鼠仔鼠0～30日齡體質(zhì)量變化,發(fā)現(xiàn)這兩種處理方式下中國(guó)地鼠仔鼠同性別間的體質(zhì)量變化差異無顯著性(P＞0.05),說明通過ICR小鼠代乳中國(guó)地鼠仔鼠,可以滿足中國(guó)地鼠對(duì)營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境等的需求(圖 1B)。

圖1 中國(guó)地鼠仔鼠的生長(zhǎng)曲線注:與雄性仔鼠比較,??P＜0.01,???P＜0.001Fig.1 The growth curves of the offspring of milk substitute Chinese hamstersNote:Compared with the male offspring,??P＜0.01,???P＜0.001

本次實(shí)驗(yàn)共剖宮24窩中國(guó)地鼠,獲得仔鼠109只,其中有4窩共出現(xiàn)了5只死胎仔,3日齡時(shí)存活的仔鼠數(shù)為78只,7日齡時(shí)存活的仔鼠數(shù)為59只,14日齡時(shí)存活的仔鼠數(shù)為57只,離乳時(shí)存活的仔鼠數(shù)為56只,代乳成功率為53.85%(表1)。

表1 中國(guó)地鼠仔鼠剖宮產(chǎn)及代乳存活情況Table 1 Caesarean section and fostering results of the offspring of Chinese hamster

2.2 代乳組仔鼠微生物和寄生蟲指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè),未檢出清潔級(jí)地鼠要求排除的微生物和寄生蟲,達(dá)到清潔級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(表2)。

表2 生物凈化后中國(guó)地鼠仔鼠微生物和寄生蟲檢測(cè)結(jié)果Table 2 Pathogen test results of the offspring of Chinese hamster after caesarean section

結(jié)論:依據(jù)GB 14922.1—2001和GB 14922.2—2011,經(jīng)檢驗(yàn),該中國(guó)地鼠微生物和寄生蟲指標(biāo)符合清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求。

3 討論

中國(guó)地鼠是我國(guó)特有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源,本實(shí)驗(yàn)通過剖宮產(chǎn)并利用ICR小鼠代乳的方式對(duì)其進(jìn)行了生物凈化。分娩前的24 h仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育最旺盛,近20%的初生體質(zhì)量在這段時(shí)間完成,且對(duì)幼仔的成活率影響很大,人們通常采用觸摸和觀察的方法判斷預(yù)產(chǎn)期[6-7]。中國(guó)地鼠尾短、皮膚緊致,抓取固定多采用握拳式,母鼠臨產(chǎn)時(shí)腹部鼓脹,為避免觸摸檢查擠傷胎仔,我們通過固定同籠時(shí)間,及時(shí)進(jìn)行陰栓、妊娠檢查,結(jié)合妊娠周期和分娩規(guī)律推算分娩時(shí)間,并采用在產(chǎn)前肌肉注射黃體酮的方式很好地完成了剖宮產(chǎn)手術(shù)。

ICR小鼠性情溫順、產(chǎn)乳周期長(zhǎng),代乳實(shí)驗(yàn)中常通過添加人工乳和輔料的方式,為仔鼠提供多種營(yíng)養(yǎng)供給[6-8]。本研究中我們根據(jù)妊娠期中國(guó)地鼠和哺乳期ICR小鼠的飼養(yǎng)操作規(guī)程,從增加供體母鼠、代乳母鼠和仔鼠的營(yíng)養(yǎng),制定了人工乳和輔料的添加方案。保障了供體母鼠的營(yíng)養(yǎng)攝取、提高了仔鼠出生質(zhì)量,也加強(qiáng)了代乳母鼠的營(yíng)養(yǎng)供給,仔鼠通過采食人工乳和輔料的活動(dòng),既增加了營(yíng)養(yǎng)攝入又增強(qiáng)了體質(zhì),并最終代乳成功。

代乳過程中的觀察稱量、輔料添加等活動(dòng)對(duì)鼠只的正常生活干擾較大,一個(gè)舒適、安全的籠盒內(nèi)環(huán)境能減少應(yīng)激。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),常用的幾種墊料材質(zhì)中木屑的粉塵較多;草紙易被叼于一處,使籠盒內(nèi)氣流不暢;玉米芯吸水性好,但干燥速度相對(duì)較慢且筑巢性差;楊木刨花的筑巢、保溫、干燥速度優(yōu)于玉米芯,但吸水性差、粉末率要高于玉米芯[6,9-10]。我們采用玉米芯加楊木刨花的方式既滿足了母鼠做窩的習(xí)性又改善了籠盒內(nèi)環(huán)境,很好地完成了代乳實(shí)驗(yàn)。

綜上所述,本研究對(duì)中國(guó)地鼠成功實(shí)施了生物凈化,達(dá)到了清潔級(jí)中國(guó)地鼠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為中國(guó)地鼠的應(yīng)用提供了保障。同時(shí),也從預(yù)產(chǎn)期判斷、營(yíng)養(yǎng)供給、墊料搭配等方面進(jìn)行了嘗試,并取得了一定效果。