魏敬軍 魏崇莉 張永霞 戴沛軍

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院檢驗(yàn)科,蘭州 730070)(2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院預(yù)防控制科,蘭州 730070)(3.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院呼吸內(nèi)科,蘭州730070)

胸科手術(shù)中肺損傷發(fā)生率較高,其中肺葉切除術(shù)是引起肺損傷的常見(jiàn)胸科手術(shù)之一,肺葉切除手術(shù)會(huì)導(dǎo)致氧自由基及炎性因子的產(chǎn)生和釋放,甚至?xí)鹣嚓P(guān)肺損傷的發(fā)生[1]。迄今為止有關(guān)肺葉切除術(shù)后的肺損傷的機(jī)制尚未被完全闡明,且暫無(wú)確切有效的治療措施。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)抑制肺葉切除術(shù)過(guò)程中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),可以明顯降低肺損傷的發(fā)生和發(fā)展,進(jìn)而改善患者預(yù)后[2-3]。Protectins是一種具有明顯抑制炎癥反應(yīng)作用的特異性促炎癥消退介質(zhì)[4]。Protectin DX(PDX)是 Protectins的重要成員[5],研究表明,PDX可以明顯減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[6],抑制促炎癥因子及中性粒細(xì)胞的聚集,促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能[7-8]。而肺葉切除術(shù)多應(yīng)用于局部肺葉內(nèi)的不可逆性病變,考慮到臨床實(shí)踐中接受肺葉切除手術(shù)的患者多為老年人,本研究將選用老年大鼠構(gòu)建肺葉切除術(shù)后肺損傷模型,用PDX進(jìn)行干預(yù)治療,初步探討PDX對(duì)老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30只SPF級(jí)健康老年雄性SD大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2017-0007,10月齡,體質(zhì)量為360～420 g。飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中,12 h/12 h明暗交替,溫度為22～25℃,相對(duì)濕度為45%～60%,自由進(jìn)食和飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要儀器及試劑

低溫冷凍離心機(jī)3K15(美國(guó) Sigma公司),Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);PDX(美國(guó) Cayman公司),大鼠 IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),OH-1、NF-κB等抗體(美國(guó) CST公司),山羊抗兔二抗(武漢安特捷生物技術(shù)有限公司),細(xì)胞總蛋白及核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó) Thermo公司)、MDA、SOD、ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)等。

1.3 大鼠肺損傷模型制備及分組

30只SD老年大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、手術(shù)組和PDX處理組,每組10只。所有大鼠于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后腹腔注射50 mg/kg體質(zhì)量戊巴比妥鈉,待麻醉成功后將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,并于右側(cè)第 4～5肋間備皮,開(kāi)胸。手術(shù)組和 PDX處理組大鼠去除第4～5肋部分肋骨,暴露右側(cè)肺,分離結(jié)扎血管及支氣管后行右下肺葉切除術(shù);假手術(shù)組除不進(jìn)行右下肺葉切除術(shù)外,其余操作同手術(shù)組及PDX處理組。所有大鼠術(shù)后進(jìn)行右胸腔閉式引流。術(shù)后待大鼠蘇醒后,放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。于造模1 h后假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠腹腔注射300μL生理鹽水,PDX處理組腹腔注射300μL PDX(500 ng)。24 h后采用過(guò)度麻醉法處死大鼠,收集各組大鼠肺組織及肺泡灌洗液,備用。

1.4 肺組織病理?yè)p傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

收集各組大鼠的右肺上葉,使用4%多聚甲醛將肺組織固定24 h后進(jìn)行脫水,透明處理,石蠟包埋,常規(guī)切片(5μm),將切片脫蠟后行蘇木精-伊紅(HE)染色,使用普通光學(xué)顯微鏡觀察肺組織損傷情況。參照美國(guó)胸科學(xué)會(huì)公布的肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)肺損傷程度進(jìn)行評(píng)定。

1.5 肺組織干濕質(zhì)量比(W/D)

收集并稱量各組大鼠新鮮的右肺中葉組織質(zhì)量,然后將肺組織放入恒溫烤箱中,烘干至恒重后再次稱重并記錄。兩次肺組織的質(zhì)量之比即為肺組織的W/D。

1.6 肺泡灌洗液中蛋白濃度檢測(cè)

結(jié)扎大鼠右肺后,使用生理鹽水灌洗左肺,每次1 mL,共3次。采集各組大鼠的肺泡灌洗液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,按照 BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)(BCA Protein Assay Kit)檢測(cè)肺泡灌洗液中的蛋白濃度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺泡灌洗液中相關(guān)炎性因子水平

取各組大鼠肺泡灌洗液適量,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和 TNF-α 水平。

1.8 3組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)

取各組大鼠肺組織勻漿,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,參照SOD、MDA、ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組肺組織中SOD活性、MDA及ROS含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織中HO-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)蛋白水平

取貯存于-80℃冰箱中的各組大鼠肺組織適量,采用RIPA試劑盒及核蛋白提取試劑盒提取肺組織總蛋白及核蛋白,采用BCA試劑盒檢測(cè)各組樣本的蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳,每個(gè)泳道加40μg總蛋白。濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。隨后將膜分別置于含HO-1(1 ∶1000)、NF-κB(1 ∶1000)、核內(nèi)參 Lamin B(1∶1000)及肺組織蛋白內(nèi)參GAPDH(1 ∶1000)的一抗稀釋液中于4℃下孵育過(guò)夜。次日回收一抗,用TBST漂洗3次,10 m in/次,隨后將膜置于用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)稀釋液中室溫下孵育1.5 h,隨后用 TBST洗膜,采用超敏 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影曝光。以Lamin B作為NF-κB的參照、GAPDH作為 HO-1蛋白的參照,應(yīng)用Image J對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間采用單因素方差分析比較,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織病理形態(tài)分析

假手術(shù)組老年大鼠肺組織肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔無(wú)增厚且無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與假手術(shù)組相比較,手術(shù)組老年大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯受損,肺泡間隔明顯增厚且可見(jiàn)大量肺泡融合,肺泡間隔及肺泡腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等,而PDX處理組損傷程度明顯減輕,肺泡間隔及肺泡腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。肺組織病理評(píng)分與鏡下觀察結(jié)果一致(P＜0.01),見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組老年大鼠肺組織損傷評(píng)分(±s,分)Table 1 Lung tissue in jury scores of aged rats in each group (±s,points)

表1 各組老年大鼠肺組織損傷評(píng)分(±s,分)Table 1 Lung tissue in jury scores of aged rats in each group (±s,points)

注:與假手術(shù)組相比,??P＜0.01;與手術(shù)組比較,##P＜0.01Note:Compared with sham group,??P＜0.01;Compared with surgery group,##P＜0.01

組別肺損傷評(píng)分 F P假手術(shù)組0.287±0.142 5.217 /手術(shù)組0.594±0.203?? 6.032 0.006 PDX 處理組 0.376±0.217## 5.469 0.009

圖1 各組肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissue in each group (×200)

2.2 3組的肺組織W/D和肺泡灌洗液中蛋白濃度對(duì)比結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:與假手術(shù)組相比,手術(shù)組大鼠肺組織W/D比值和肺泡灌洗液中的蛋白濃度明顯增加(P＜0.01);與手術(shù)組相比較,PDX處理組大鼠的W/D比值和肺泡灌洗液中的蛋白濃度明顯下降(P＜0.01),見(jiàn)表 2。

表2 3組大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中的蛋白濃度分析Table 2W/D ratio of three groups of rats and analysis of protein concentration in alveolar lavage fluid

2.3 3組大鼠肺泡灌洗液中相關(guān)炎癥因子分析

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液中 IL-1β及TNF-α、IL-6水平。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:手術(shù)組大鼠肺部的 IL-1β、TNF-α、IL-6水平高于假手術(shù)組(P＜0.05,P＜0.01);與手術(shù)組相比,PDX處理組的IL-1β、TNF-α、IL-6水平明顯下降(P＜0.05,P＜0.01),見(jiàn)表 3。

2.4 3組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激評(píng)價(jià)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:與假手術(shù)組相比較,手術(shù)組老年大鼠肺組織中MDA和ROS含量顯著升高(P＜0.05),而SOD活性明顯降低(P＜0.05);與手術(shù)組老年大鼠相比較,PDX處理組老年大鼠肺組織中MDA和ROS含量顯著減少(P＜0.05),而 SOD 活性明顯上調(diào)(P＜0.05),見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠的肺組織灌洗液中的IL-1β、TNF-α及IL-6 水平分析(±s,pg/mL)Table 3 Analysis of IL-1β,TNF-αand IL-6 levels in lung tissue lavage fluid of each group of rats(±s,pg/mL)

表3 各組大鼠的肺組織灌洗液中的IL-1β、TNF-α及IL-6 水平分析(±s,pg/mL)Table 3 Analysis of IL-1β,TNF-αand IL-6 levels in lung tissue lavage fluid of each group of rats(±s,pg/mL)

注:與假手術(shù)組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與手術(shù)組比較,##P＜0.05Note:Compared with sham group,?P＜0.05,??P＜0.01;Compared with surgery group,##P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α IL-6假手術(shù)組 16.847±3.204 30.183±5.270 176.014±8.270手術(shù)組 39.876±4.093? 248.064±5.864?? 790.207±9.478??PDX 處理組 27.564±3.814##129.857±6.028## 518.706±8.912##F 13.901 19.328 23.762 P 0.023 0.000 0.000

表4 各組老年大鼠的肺組織中M DA、ROS 及 SOD 表達(dá)水平(±s)Table 4 MDA,ROS and SOD expression levels in lung tissue of aged rats in each group(±s)

表4 各組老年大鼠的肺組織中M DA、ROS 及 SOD 表達(dá)水平(±s)Table 4 MDA,ROS and SOD expression levels in lung tissue of aged rats in each group(±s)

注:與假手術(shù)組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與手術(shù)組比較,#P＜0.05,##P＜0.01Note:Compared with sham grou,?P ＜ 0.05,??P ＜ 0.01;Compared with surgery,#P＜0.05,##P＜0.01

組別 MDA/(μmol/L) ROS(U/mL) SOD/(U/mg)假手術(shù)組 127.017±5.174 1.043±0.701 41.025±4.207手術(shù)組 192.864±4.894? 4.870±0.945?? 16.461±1.608?PDX 處理組 151.207±6.045# 2.516±0.728## 27.504±2.862##F 15.119 2.840 7.224 P 0.037 0.000 0.013

2.5 3組老年大鼠肺組織中HO-1、NF-κB蛋白的表達(dá)情況

由Western blot檢測(cè)結(jié)果可知:與假手術(shù)組相比較,手術(shù)組大鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05),HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05);與手術(shù)組相比較,PDX處理組大鼠肺組織中 NF-κB蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05),HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著提高(P＜0.05),見(jiàn)表5、圖2。

表5 各組大鼠的肺組織中HO-1及NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Table 5 Relative exp ression levels of HO-1 and NF-κB protein in lung tissue of rats in each group

圖2 各組大鼠的肺組織中HO-1及NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of HO-1 and NF-κB protein in lung tissue of rats in each group

3 討論

迄今為止,有關(guān)肺葉切除術(shù)后肺損傷發(fā)生的確切機(jī)制尚未被完全闡明,但有大量研究表明肺葉切除手術(shù)后氧化應(yīng)激損傷和炎性因子的大量產(chǎn)生是導(dǎo)致肺損傷主要因素。PDX作為特異性促炎癥消退介質(zhì),具有強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制相關(guān)炎癥因子釋放的作用[10-12],但目前尚無(wú)有關(guān)報(bào)道分析PDX對(duì)老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷的保護(hù)作用。

本研究通過(guò)肺葉切除術(shù)構(gòu)建老年大鼠肺損傷模型來(lái)初步探索PDX對(duì)老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷的保護(hù)作用,評(píng)估肺葉切除術(shù)后肺組織的損傷程度,衡量肺組織微血管的通透性和肺組織的水腫程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,老年大鼠肺葉切除術(shù)后存在明顯肺損傷現(xiàn)象,而PDX的干預(yù)可改善肺損傷的程度,提示PDX對(duì)老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷具有一定的治療作用。

過(guò)度的炎癥反應(yīng)是老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷發(fā)生的重要原因之一,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺葉切除術(shù)可以使肺組織中的 IL-6、TNF-α、IL-1β均明顯升高,提示大鼠肺葉切除術(shù)后會(huì)產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為大量的促炎癥因子釋放,從而加重肺損傷。PDX的干預(yù)可以明顯抑制相關(guān)炎性因子的釋放,減輕肺損傷。有研究表明,肺葉切除術(shù)后肺組織會(huì)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng),表現(xiàn)為氧化因子和抗氧化因子水平的異常,過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致肺損傷的主要誘因之一[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比較,手術(shù)組老年大鼠肺組織中SOD活性降低,ROS和 MDA含量升高(P＜0.05),當(dāng)給予 PDX干預(yù)后SOD活性升高,ROS和MDA含量降低,提示PDX可以通過(guò)抑制肺組織氧化應(yīng)激損傷來(lái)減輕肺組織損傷。

在機(jī)體處于正常的生理?xiàng)l件下,IκBα與 NF-κB的p65亞單位結(jié)合形成復(fù)合物[14]以無(wú)活性的結(jié)合型存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)受到細(xì)胞因子、活性氧等刺激后,IκBα發(fā)生降解,NF-κB被激活且隨之轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)炎癥信使參與炎癥反應(yīng)[15]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是促進(jìn)NF-κB 活化的重要因素[16-17],而HO-1是人體內(nèi)血紅素代謝途徑中的限速酶,其間接代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)大的抗氧化功能[18]。HO-1作為一種保護(hù)性蛋白,其抗氧化、抗炎等多種功能已經(jīng)得到證實(shí)[19-20],HO-1對(duì)急性肺損傷的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)也具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[21]。

因此推測(cè)PDX對(duì)老年大鼠肺葉切除術(shù)后肺損傷的保護(hù)作用可能與 NF-κB和 HO-1的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明,肺葉切除術(shù)后老年大鼠肺組織中HO-1蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05),NF-κB蛋白的表達(dá)明顯增加,PDX的干預(yù)可促進(jìn)HO-1的表達(dá),同時(shí)抑制 NF-κB的表達(dá)。這提示PDX的干預(yù)可抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng),且這種作用可能與促進(jìn)HO-1的表達(dá)和抑制NF-κB的表達(dá)密切相關(guān)。

綜上所述,老年大鼠肺葉切除術(shù)后的肺損傷與機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān),且PDX可以通過(guò)促進(jìn)HO-1表達(dá)和抑制NF-κB表達(dá)減輕老年大鼠肺葉切除術(shù)后的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。