王 繼 楊中亞 張 龍

(六盤水師范學(xué)院體育學(xué)院,六盤水 553004)

伴隨高能量飲食習(xí)慣和缺乏運(yùn)動的生活方式盛行,2型糖尿病的患病率在世界范圍呈逐年上升趨勢。2型糖尿病的發(fā)病進(jìn)程與肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān),這種早期的癥狀若未得到有效控制,機(jī)體長期的高血糖和高血脂導(dǎo)致糖毒性、脂毒性將進(jìn)一步誘導(dǎo)胰島B細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致胰島素分泌下降,最終產(chǎn)生嚴(yán)重的糖脂代謝紊亂[1]。

未得到良好控制的2型糖尿病最終將表現(xiàn)出葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝全面受損的特征,在骨骼肌受損方面主要表現(xiàn)為損傷后不易愈合和骨骼肌萎縮[2]。骨骼肌作為外周攝取葡萄糖的重要組織,其質(zhì)量和功能的降低將進(jìn)一步加劇2型糖尿病的代謝障礙[3]。嚴(yán)重的糖尿病肌萎縮常出現(xiàn)在2型糖尿病發(fā)病后期,但自發(fā)性2型糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展常需要數(shù)十年。因此,在科研和臨床上迫切需要在短時間內(nèi)建立符合2型糖尿病臨床特征的動物模型用于2型糖尿病代謝障礙及其并發(fā)癥治療方法的探索。

高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素注射(HFD/STZ)是最常用的實(shí)驗(yàn)性非自發(fā)性糖尿病模型。通過高脂飼養(yǎng)引起高胰島素血癥,在機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗和/或葡萄糖不耐受后,腹腔注射胰島B細(xì)胞毒素STZ,快速導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低,從而在更短的時間內(nèi)模擬出2型糖尿病的病理過程[4-6]。

本研究擬通過9周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔小劑量STZ注射建立2型糖尿病大鼠模型,觀察建模后2型糖尿病大鼠的基本代謝情況,分析評價骨骼肌的變化特征,以期為快速建立2型糖尿病骨骼肌并發(fā)癥動物模型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性 Sprague-Dawley大鼠39只,體質(zhì)量(214.1±7.7)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0006],飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 SPF級動物房[SYXK(京)2016-0003]。高脂飼料能量比為:脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質(zhì)20%,購于北京華阜康生物科技股份有限公司[11003800009547]。實(shí)驗(yàn)通過北京體育大學(xué)運(yùn)動科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購于 Sigma公司(S0130);大鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒購于Mercodia公司(10-1250-01);甲苯胺藍(lán)溶液購于北京索萊寶科技有限公司(G3668);221(2-amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、ATP二鈉鹽購于 Sigma公司;其余分析純試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。血糖儀購于強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司(穩(wěn)擇易?血糖儀),酶標(biāo)儀購于 BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 建立2型糖尿病肌萎縮模型:所有大鼠以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,隨機(jī)取15只大鼠為對照組(Control group,C組),給予普通飼料飼養(yǎng)9周;其余24只大鼠為高脂飼料組,給予高脂飼料飼養(yǎng)9周。高脂飼料組于9周飼養(yǎng)后間隔3 d空腹?fàn)顟B(tài)下連續(xù)注射2次STZ(25 mg/kg體質(zhì)量),對照組腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。以STZ注射后第3天空腹血糖≥11.1 mmol/L作為2型糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)[7],剔除不成模大鼠,最終得到2型糖尿病模型組(Diabetes group,D組)大鼠20只,建模率為83.3%。繼續(xù)飼養(yǎng)6周,觀察模型穩(wěn)定性,在2型糖尿病代謝指標(biāo)穩(wěn)定狀態(tài)下分析骨骼肌萎縮情況。

1.2.2 樣本測試分析:血樣測試與計(jì)算:STZ注射前后,將所有大鼠禁食12 h后取尾血,血糖儀檢測空腹血糖濃度(Fasting blood glucose,FBG),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清胰島素(Fasting serum insulin,FINS)水平。以此計(jì)算大鼠胰島素抵抗和敏感性指數(shù),胰島素敏感性指數(shù)ISI=1/FBG(mmol/L)×FINS(IU/L),胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=FINS(IU/L)×FBG(mmol/L)/22.5。

骨骼肌樣本采集:對每只實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉,腹主動脈取血;分離比目魚肌,在腹肌處切成0.5 cm×0.3 cm×0.3 cm長塊狀放入OCT模具中,樣本于液氮預(yù)冷的異戊烷中進(jìn)行固定,用于制備切片。

肌纖維類型染色與分析:每組隨機(jī)抽取12只大鼠的比目魚肌樣本用于制取8μm厚度的冰凍切片。參考王月麗等[8]改良的ATP-ase染色方案鑒別肌纖維類型:室溫環(huán)境復(fù)溫5 min,預(yù)孵育液中室溫預(yù)孵育2 min,Tris緩沖液洗2 m in×3次,甩干,孵育液中室溫孵育15 min,1%CaCl2·2H2O水溶液中換洗三次(每次提拉切片3～4次),終止ATP-ATPase反應(yīng)。0.1%甲苯胺藍(lán)水溶液染色90 s,流水沖洗切片10～20 s,依次于95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇中快速脫水(每次提拉切片3～5次),二甲苯透明,中性樹膠封片。數(shù)碼體視顯微鏡拍片,在200倍視野下每個樣本隨機(jī)采集4個圖像用Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)不同類型肌纖維平均橫截面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以(±s)表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P＜0.05為顯著差異,P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病大鼠體質(zhì)量變化規(guī)律

高脂飼養(yǎng)9周后,模型組大鼠體質(zhì)量和對照組無顯著差異(P＞0.05),之后對模型組進(jìn)行腹腔注射STZ。STZ注射后,模型組大鼠體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢,且2～6周極顯著低于對照組(P＜0.01),至注射后第6周趨于穩(wěn)定。見表1。

2.2 2型糖尿病大鼠血糖變化情況

高脂飼養(yǎng)9周后,模型組大鼠血糖顯著高于對照組(P＜0.05);在 STZ注射后,模型組大鼠血糖進(jìn)一步升高,且2～6周極顯著高于對照組(P＜0.01)。模型組穩(wěn)定性顯示,至注射后第4周逐步趨于穩(wěn)定,見表 2。

2.3 2型糖尿病大鼠胰島素水平和胰島素敏感性變化情況

分別于STZ注射前、STZ注射后2周和6周對大鼠血清胰島素水平進(jìn)行測試,計(jì)算 HOMA-IR和ISI。模型組大鼠的FINS水平在STZ注射前極顯著高于對照組(P＜0.01),注射后極顯著低于對照組(P＜0.01),HOMA-IR在 STZ注射前后均極顯著高于對照組(P＜0.01),ISI均極顯著低于對照組(P＜0.01)。FINS水平在 STZ注射后2周極顯著降低(P＜0.01),并趨于穩(wěn)定,HOMA-IR和 ISI在 STZ注射前后較為穩(wěn)定,無顯著變化,見表3。

表1 STZ注射前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況Table 1 Changes of body weight before and after STZ injection in rats of each group

表2 STZ注射前后各組大鼠血糖變化情況Table 2 Changes of blood glucose before and after STZ injection in rats of each group

表3 STZ注射前后各組大鼠FINS、HOM A-IR和ISI變化情況Table 3 Changes of FIN,HOM A-IR and ISI before and after STZ injection in rats of each group

2.4 2型糖尿病大鼠骨骼肌纖維萎縮的特征分析

ATP-ase染色結(jié)果顯示,Ⅰ型肌纖維呈淺藍(lán)色,Ⅱ型肌纖呈深藍(lán)色,為消除染片不同批次間色彩飽和度(純度)的差異,統(tǒng)一去色。去色后灰色為Ⅰ型肌纖維,黑色為Ⅱ型肌纖維。見圖1。

圖1 比目魚肌肌纖維類型染色結(jié)果(×20)注:C:對照組;D:2型糖尿病組Fig.1 Staining results of soleusmuscle fiber types(×20)Note:C:Control group;D:Type 2 Diabetes group

與對照組相比,模型組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維平均橫截面積均顯著降低,其中Ⅰ型肌纖維平均橫截面積降低幅度達(dá)到34.8%(P＜0.01),Ⅱ型肌纖維平均橫截面積降低幅度為14.1%(P＜0.05),骨骼肌萎縮現(xiàn)象明顯。見表4。

表4 比目魚肌肌纖維平均橫截面積變化情況Table 4 Changes of mean cross-sectional area of soleusmuscle fiber

3 討論

3.1 HFD/STZ建立2型糖尿病大鼠模型的基本特征分析

Reed等[9]在2000年率先報道了一種快速建立的新型2型糖尿病大鼠模型,先通過高脂飼養(yǎng)2周誘導(dǎo)胰島素抵抗,然后一次性注射大劑量胰島B細(xì)胞特異性毒素STZ(50 mg/kg體質(zhì)量)來快速建立胰島素抵抗和血糖升高的2型糖尿病模型(HFD/STZ)。為了保障該模式下2型糖尿病模型的穩(wěn)定性和成模率,逐漸發(fā)展為以較長的高脂飼養(yǎng)時間聯(lián)合小劑量STZ連續(xù)多次注射來建立2型糖尿病模型[10-13]。在本研究中,9周高脂飼養(yǎng)已經(jīng)明顯誘導(dǎo)模型組大鼠空腹血糖和胰島素水平升高,外周胰島素抵抗程度增加,胰島素敏感性降低。通過9周高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)模型組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)上升趨勢,但要達(dá)到體質(zhì)量顯著增加則需要更長的飼養(yǎng)時間,提示高脂飼養(yǎng)的時間對HFD/STZ建立2型糖尿病大鼠模型的特征有較大影響。

本研究在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上,采用連續(xù)注射2次小劑量STZ(25 mg/kg)最終建立2型糖尿病模型,建模率達(dá)83.3%。模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降,血糖顯著升高,并在成模后4周后逐步穩(wěn)定;建模后胰島素水平始終處于較低水平,胰島素抵抗明顯、胰島素敏感性顯著下降。進(jìn)一步驗(yàn)證了高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ注射能有效建立符合2型糖尿病代謝特征的實(shí)驗(yàn)動物模型,具有建模周期短、疾病特征明顯等優(yōu)勢,但建模后2型糖尿病基本特征的穩(wěn)定需要一段時間(約4周)。

3.2 HFD/STZ建立2型糖尿病大鼠的骨骼肌特征分析

根據(jù)代謝特征的不同,可以將骨骼肌纖維簡單地分為氧化型肌纖維(Ⅰ型)和酵解型肌纖維(Ⅱ型)。Ⅰ型肌纖維主要依靠有氧代謝途徑提供能量,由于毛細(xì)血管和線粒體豐富、有氧代謝酶活性較強(qiáng),Ⅰ型肌纖維持續(xù)氧化供能和抗疲勞能力較強(qiáng);Ⅱ型肌纖維主要依靠糖酵解代謝途徑來供能,由于線粒體數(shù)量和氧化酶含量較少,氧化供能和抗疲勞能力較差[14]。

在本研究中,模型組大鼠整體指標(biāo)在STZ注射后4周基本穩(wěn)定,在第6周時檢測了大鼠比目魚肌的不同類型肌纖維的變化情況。ATP-ase染色顯示模型組大鼠存在明顯的肌萎縮現(xiàn)象,具體表現(xiàn)為Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維平均橫截面積均顯著降低,其中Ⅰ型肌纖維萎縮程度更明顯,平均橫截面積降低幅度達(dá)到34.8%,Ⅱ型肌纖維平均橫截面積降低幅度為14.1%。

Ⅰ型肌纖維中糖有氧氧化關(guān)鍵酶活性、胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter

protein 4,GLUT-4)的表達(dá)量均高于Ⅱ型肌纖維,因此Ⅰ型肌纖維對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的貢獻(xiàn)率更高[15]。而骨骼肌的萎縮,尤其是葡萄糖代謝能力強(qiáng)的Ⅰ型肌纖維的萎縮,是進(jìn)一步加劇2型糖尿病代謝障礙的重要原因之一。在2型糖尿病環(huán)境下,長期脂質(zhì)堆積和慢性炎癥導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化能力降低、細(xì)胞凋亡增加、收縮蛋白合成和降解失衡,導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞呈現(xiàn)數(shù)量降低和橫截面積的下降,最終發(fā)展成肌萎縮[3]。

自發(fā)性2型糖尿病肌萎縮模型建模周期一般很長,在本研究建立的模型中,STZ注射后4周整體指標(biāo)表現(xiàn)較為穩(wěn)定,在第6周時已出現(xiàn)明顯的肌萎縮現(xiàn)象,同時表現(xiàn)出Ⅰ型肌纖維萎縮更為明顯的典型特征。該建模方法具有建模時間短、狀態(tài)穩(wěn)定和特征明顯的優(yōu)勢,是進(jìn)一步研究運(yùn)動和藥物干預(yù)治療2型糖尿病肌萎縮、提高骨骼肌容量和功能,改善2型代謝障礙較為理想的模型。