李松，徐朝旭，林陳瑩，魏勝華，李艷賓

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)

阿魏酸酯酶又稱肉桂酸酯酶，屬于羧酸水解酶的一個亞類[1]，主要應用于作為膳食纖維補充劑阿魏酸的分離制備及酚酸化合物的合成[2-4]，在造紙工業(yè)中可與漆酶、纖維素酶等通過協(xié)同作用去除木質素并提高纖維素降解效率[5]，亦可應用于飼料的預處理以提高反芻動物對飼料營養(yǎng)的吸收[6]。此外，阿魏酸酯酶可以加速木質纖維素的降解，在生物質利用和燃料乙醇的生產中亦具有重要的應用前景。

阿魏酸酯酶首次于1987年在藍色鏈霉菌屬(Streptomycesolivochromogenes)中發(fā)現[7]，FAULDS等[8]在1991年第一次從該菌中將阿魏酸酯酶分離純化，之后諸多阿魏酸酯酶在不同的微生物中被發(fā)現。目前,已從微生物中發(fā)現了40多種阿魏酸酯酶，其中曲霉屬約占產阿魏酸酯酶微生物的1/3[9-12]。真菌中主要有黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉、黃柄曲霉、繩狀青霉、泡盛曲霉、塔賓曲霉和里氏木霉等[13]，細菌中主要有溶纖維丁酸弧菌、纖維弧菌、熱纖維梭菌、嗜酸乳酸桿菌和光假單胞菌等[14]。雖然阿魏酸酯酶存在范圍較廣，且真菌、細菌和植物中的阿魏酸酯酶均分別得到了深入研究[15-19]，但是目前已報道的微生物發(fā)酵產阿魏酸酯酶水平普遍不高，尚不能滿足工業(yè)化生產需求。因此通過自然選育獲得阿魏酸酯酶高產菌株依然是目前解決阿魏酸酯酶工業(yè)發(fā)酵產酶水平過低的重要方法之一[9,20-21]。本研究以篩選阿魏酸酯酶高產菌株為目的，從多種自然樣本中篩選得到8株產阿魏酸酯酶絲狀真菌，并對其中1株產阿魏酸酯酶能力最高的菌株進行了分子生物學鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為阿魏酸酯酶產生菌種的選育和工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司；色譜純甲醇，SIGMA公司；麩皮、豆渣、黃豆餅粉、玉米粉，市場；稻草秸稈，農村；阿魏酸、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯，上海源葉生物科技有限公司；T-載體、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產品；5.8S ITS-rDNA PCR擴增通用引物(ITS1和ITS4)，上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 自然樣本

自然土壤樣本分別采自安徽天堂寨風景區(qū)和安徽蕪湖神山公園。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15，自然pH。115 ℃滅菌20 min，在冷卻至55 ℃左右時添加卡那霉素至終質量濃度為50 μg/mL，搖勻后倒平板。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15，Triton X-100 0.2，自然pH。115 ℃滅菌20 min，在冷卻至55 ℃時按每100 mL培養(yǎng)基加入1.5 mL體積分數為 10%阿魏酸乙酯(二甲基亞砜)溶液，并添加卡那霉素至終質量濃度為50 μg/mL，搖勻后倒平板。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白10，K2HPO41，pH 6.0，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：FeSO4·7H2O 0.01，NaNO32，NH4Cl 3，豆餅粉5，蔗糖10，玉米漿干粉5，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，麥麩20，pH 6.0，于115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PCR儀(TC312)，美國TECH公司；組合式恒溫搖床(HYL-C)，太倉市強樂實驗設備有限公司；恒溫金屬浴(HB-100)，杭州博日科技有限公司；pH計(FE20)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；離心機(1-14)，德國SIGMA公司；高效液相色譜儀(P230)，大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種篩選與鑒定

(1)菌種初篩：將不同土樣使用無菌水進行10倍稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后，挑取生長出來的真菌菌絲接種至初篩培養(yǎng)基，繼續(xù)于30 ℃培養(yǎng)4 d后觀察其是否產生透明圈，選擇產生透明圈的真菌進行搖瓶發(fā)酵并測定阿魏酸酯酶酶活力。

(2)菌種復篩：將初篩菌株在PDA平板中培養(yǎng)4 d后，使用10 mL無菌水洗下孢子后，接種1 mL孢子懸液至種子培養(yǎng)基30 mL/250 mL，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后按體積分數為10%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL/250 mL，并于30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵6 d后測定阿魏酸酯酶酶活力。選取發(fā)酵酶活力高的菌株進行后續(xù)實驗。

(3)篩選菌株分子生物學鑒定：真菌染色體DNA提取、質粒DNA小量制備及DNA連接、轉化等分子操作參照文獻[22]進行。以染色體DNA為模板，分別以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為上下游引物，在54 ℃下進行擴增，得到PCR產物經純化后連接T-載體，提取重組質粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因序列測定。所得ITS-rDNA序列的比對及菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建參見文獻[23]進行。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活力測定

阿魏酸酯酶酶活力測定：參考ZHANG等[24]方法進行酶催化反應，反應中釋放的阿魏酸含量采用高效液相色譜法測定[25]。色譜條件為色譜柱：ODS-C18；柱溫：40 ℃；流動相：V(體積分數1%乙酸)∶V(甲醇)=72∶28；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。酶活力定義：在該反應條件下，1 min降解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 單因素優(yōu)化

(1)單因素實驗：采用1.3.1小節(jié)所述菌種復篩發(fā)酵條件，分別將培養(yǎng)溫度設置為24～34 ℃以研究不同溫度對發(fā)酵產酶的影響；分別將發(fā)酵液初始pH調節(jié)至4～8，以研究pH對發(fā)酵產酶的影響；分別將碳源(10 g/L)調整為葡萄糖、糊精、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和木糖，以研究不同碳源對菌株產酶的影響；分別將氮源調整為NaNO3、(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl、豆餅粉、玉米漿干粉和豆渣至最終含氮量為2 g/L，以研究不同氮源對菌株產酶的影響；分別將誘導物(10 g/L)調整為啤酒糟、秸稈、玉米粉、玉米漿和麩皮，以研究不同物質對菌株誘導產酶的影響。

(2)單因素爬坡實驗：將最適碳源的質量濃度調至10～40 g/L，最適氮源的質量濃度調至20～120 g/L，最適誘導物的質量濃度調至10～40 g/L，以研究碳源、氮源和誘導物質量濃度對菌株產酶的影響。

1.3.4 中心組合設計實驗

根據單因素爬坡實驗結果，對蔗糖、豆渣和啤酒糟3個因素進行Box-Benhnken實驗，每個因素取3個水平，響應值為阿魏酸酯酶酶活力(U/L)，實驗設計見表1。

表1 響應面實驗設計 單位：g/L

2 結果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

2.1.1 菌種篩選

從不同土壤樣本中共篩得到43株絲狀真菌，其中有8株可在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)后產生透明圈，如圖1所示。搖瓶發(fā)酵復篩結果表明，菌株W2發(fā)酵活力相對較高，如圖2所示，因此在后續(xù)實驗中采用W2作為出發(fā)菌株進行研究。

圖1 平板初篩結果Fig.1 Primary screening results

圖2 篩選菌株發(fā)酵產阿魏酸酯酶酶活力比較Fig.2 Activity of feruloyl esterase produced by isolated strains

2.1.2 菌種鑒定

以菌株W2染色體DNA為模板進行PCR擴增，所得5.8S ITS-rDNA序列經測序、同源比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株W2與曲霉屬(Aspergillussp.)同源性較高，如圖3所示。在鑒定到種的菌株中與1株土曲霉菌株(AspergillusterreusX3)同源性最高(GenBank登錄號：KU573776.1；同源性：100%)，因此，基于系統(tǒng)發(fā)育樹分析和同源性比對分析結果，將W2鑒定為土曲霉。

圖3 W2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of W2 strain

2.2 單因素實驗

2.2.1 發(fā)酵溫度和pH對產酶的影響

由圖4-a可知，當培養(yǎng)溫度為26 ℃時土曲霉W2發(fā)酵產阿魏酸酯酶酶活力最高，且隨著溫度上升，發(fā)酵酶活力急劇下降。由圖4-b可知，土曲霉W2的最適產酶pH為5.0，且隨著pH升高，酶活力逐漸降低。

圖4 溫度和pH對土曲霉W2發(fā)酵產阿魏酸酯酶的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the activity of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.2.2 碳源、氮源和誘導物對產酶的影響

如圖5-a所示，不同碳源對土曲霉W2產酶的影響不同，添加蔗糖時產酶效果最好，其次為木糖，而使用乳糖時產酶效果最差。如圖5-b所示，天然的復合氮源產酶效果較好，如豆渣和玉米漿干粉，而銨鹽對發(fā)酵產酶效果最差，如NH4Cl和(NH4)2SO4。阿魏酸酯酶是一種誘導酶，因此在發(fā)酵過程中通常需要添加誘導物以提高發(fā)酵產酶水平，如圖5-c所示，使用啤酒糟時所得阿魏酸酯酶活力最高，其次為麩皮和秸稈，而采用玉米粉時誘導產酶效果較差。

a-碳源對發(fā)酵產酶的影響；b-氮源對發(fā)酵產酶的影響；c-誘導物對發(fā)酵產酶的影響圖5 碳源、氮源及誘導物對土曲霉W2產阿魏酸酯酶的影響Fig.5 Effect of carbon source， nitrogen source and inducer on the activity feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.3 爬坡實驗

分別選擇單因素實驗中產酶效果最好的碳源、氮源和誘導物進行爬坡實驗，如圖6所示，蔗糖、豆渣和啤酒糟的質量濃度分別采用30、80和25 g/L時所獲得的發(fā)酵酶活力最高。

2.4 響應面設計優(yōu)化

圖6 蔗糖、豆渣及啤酒糟對土曲霉產阿魏酸酯酶的影響Fig.6 Effect of sucrose, bean dregs and brewer’s grains on the activity level of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

表2 響應面實驗結果分析Table 2 Analysis of response surface experiment results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

圖7 不同變量交互作用對產酶的影響曲面圖Fig.7 Surface plot for the effect of different variables interaction on the activity of feruloyl esterase produced by A. terreus W2

3 結論與討論

目前研究報道的阿魏酸酯酶產酶水平較高的絲狀真菌多為曲霉屬，本研究從大量絲狀真菌中篩選得到1株阿魏酸酯酶高產菌株，經鑒定為土曲霉，同屬于曲霉屬。對篩選菌株土曲霉W2進行了單因素試驗和響應面設計優(yōu)化，結果表明使用啤酒糟作為誘導物時產酶效果最好，碳、氮源分別使用蔗糖和豆渣時產酶效果最好，最適產酶溫度和pH分別為26 ℃和5.0。最終優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成(g/L)：葡糖糖30，啤酒糟24.5，豆渣81，FeSO4·7H2O 0.01，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，pH 5.0。使用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵6 d后阿魏酸酯酶酶活力達到205 U/L，約為優(yōu)化前產酶水平的3倍。目前阿魏酸酯酶表達量較高的多為異源表達，如李兵等[26]將密碼子優(yōu)化后的黑曲霉阿魏酸酯酶基因在畢赤酵母中進行表達，獲得最大表達量為(39.9±0.1)U/mL，遠遠高于本研究利用原始菌株所得表達水平，表明本研究所得結果距離工業(yè)化應用尚有很大差距。綜上所述，本研究為阿魏酸酯酶高產菌株的選育和基因工程菌的構建提供了1株良好出發(fā)菌株，發(fā)酵優(yōu)化結果為該菌株的后續(xù)放大發(fā)酵和應用研究奠定了基礎。同時，菌種誘變選育和阿魏酸酯酶基因的異源表達將是本研究后期的主要方向。