尹抗抗 聶 娟 唐 標(biāo)

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410028)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝相關(guān)性疾病，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要特征，其疾病譜包括單純性脂肪肝炎及由其演變的NAFLD、肝硬化和肝細(xì)胞癌，目前是全球最常見的慢性肝臟疾病[1-3]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[4,5]。近期研究顯示，NLRP3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的核心部分介導(dǎo)NAFLD發(fā)生發(fā)展，NLRP3活化可加速疾病進(jìn)展，抑制NLRP3炎癥小體活化可減輕NAFLD炎癥反應(yīng)，延緩疾病進(jìn)展，NLRP3炎癥小體已成為NAFLD的重要治療靶點(diǎn)[6-10]。

降脂理肝湯是張?jiān)迄i教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑，由澤瀉、丹參、決明子、郁金、海藻和荷葉6味中藥組成，臨床觀察表明，降脂理肝湯具有調(diào)脂、護(hù)肝、減肥等作用，治療NAFLD療效確切[11]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，降脂理肝湯能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠脂代謝，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)整腸道菌群，改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[12,13]。但NLRP3炎癥小體是否介導(dǎo)降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制尚未明確，因此本研究觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD中炎癥小體活化的影響，探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 降脂理肝湯由澤瀉10 g、決明子30 g、丹參10 g、郁金10 g、海藻30 g、荷葉10 g組成，中藥飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)陳曉陽(yáng)教授鑒定符合治療標(biāo)準(zhǔn)。上述藥物加8倍量水浸泡30 min后，沸后煎煮1 h后過濾，再加6倍量水沸后煎煮1 h過濾，兩次藥液混合，于65℃減壓旋蒸濃縮為2 g/ml濃縮液，4℃冷藏儲(chǔ)存，臨用前采用生理鹽水稀釋成所需濃度。高脂飼料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠75只，體質(zhì)量(150±10)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(湘)2017-0003。

1.1.3試劑 NLRP3特異性抑制劑MCC950(批號(hào)：S7809)購(gòu)自Selleck公司；水合氯醛(批號(hào)：8MQ20-CC)購(gòu)自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Western blot及IP細(xì)胞裂解液(批號(hào)：P0013)購(gòu)自碧云天公司；蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，100×DMSO儲(chǔ)液，批號(hào)：B14002)、磷酸酶抑制劑Cocktail (100×，批號(hào)：B15002)購(gòu)自Bimake；IL-1β(批號(hào)：ab9787)、IL-18 (批號(hào)：ab191860)兔抗多克隆抗體購(gòu)自Abcam；Caspase-1(批號(hào)：NBP1-45433)、NLRP3(批號(hào)：NBP2-12446)兔抗多克隆抗體購(gòu)自Novus Bio-logicals；GAPDH兔抗多克隆抗體(批號(hào)：G9545)購(gòu)自Sigma；山羊抗兔二抗(批號(hào)：AP132P)購(gòu)自Merck。

1.1.4儀器 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；LEICADNLB2型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；Shandon325石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon公司)。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型的建立 高脂飼料喂養(yǎng)12周建立NAFLD大鼠模型[12，13]。高脂飼料配方：脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%、標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料82.5%。

1.2.2動(dòng)物分組和藥物干預(yù) SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、降脂理肝湯組和NLRP3特異性抑制劑MCC950組，其中降脂理肝湯給藥劑量參照前期研究，按照動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，設(shè)3個(gè)劑量，分別為降脂理肝湯低劑量組(2.3 g/kg)、降脂理肝湯中劑量組(4.6 g/kg)和降脂理肝湯高劑量組(9.2 g/kg)[12,13]。MCC950給藥劑量參照文獻(xiàn)[7]為10 mg/kg。正常組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組和降脂理肝湯高脂飼料喂養(yǎng)12周后，每組隨機(jī)抽取3只，取肝組織進(jìn)行HE染色，觀察組織病理學(xué)變化，觀察到高脂飼料小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的脂肪變性和空泡樣變，表示模型成功。灌胃給予降脂理肝湯和MCC950，1次/d，連續(xù)6周，每周稱重1次，按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，藥物干預(yù)期間，喂養(yǎng)方式同1.2.1。干預(yù)結(jié)束后，取各組大鼠血液和肝臟待測(cè)。

1.2.3血清ALT和AST水平檢測(cè) 將全血以3 000 r/min 離心10 min后，吸取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清 ALT和AST水平。

1.2.4肝組織HE染色及肝臟病理學(xué)改變?cè)u(píng)分 取各組大鼠同位段肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗1～2次，濾紙吸干后置于4%多聚甲醛中固定。將組織進(jìn)行石蠟包埋，切4 μm厚片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上進(jìn)行常規(guī)HE染色。封片后光鏡下觀察各組大鼠子宮病理變化情況并進(jìn)行氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院非酒精性脂肪性肝炎臨床研究病理工作組指南。

1.2.5Western blot 每組選取5只大鼠，取大鼠同部位肝臟組織100 mg，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液1 ml于冰上混勻30 min，提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NLRP3 (1∶1 000)、Caspase-1 (1∶500)、IL-1β (1∶1 000)、IL-18 (1∶1 000)和GAPDH (1∶5 000)一抗4℃孵育過夜，洗滌后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育l h，洗滌后ECL顯色曝光，Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行圖像定量分析，測(cè)定目的蛋白的相對(duì)光密度值(IOD)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白IOD與內(nèi)參蛋白IOD比值，以此表示蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠血清ALT水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，降脂理肝湯各組和MCC950組大鼠血清AST水平顯著降低，且各劑量組呈濃度依賴性(P<0.01)。見表1。

2.2降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 HE染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞呈多邊形,核大而圓,位于肝細(xì)胞中央，偶見肝組織脂肪變性，肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無纖維組織增生；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,伴有氣球樣變,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟脂肪變性明顯，可見肝細(xì)胞腫大變圓,內(nèi)有巨大脂肪滴,未見肝纖維化及肝硬化；各藥物組均有不同程度脂肪變性,但相較于模型組明顯減輕,氣球樣變減少，見圖1。如圖2、表3所示，與正常組相比，模型組小鼠氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分顯著升高(P<0.01)，而降脂理肝湯各劑量組和MCC950組評(píng)分顯著降低，且呈濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 降脂理肝湯對(duì)大鼠血清ALT和AST水平的影響

圖1 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝臟病理組織學(xué)改變的影響(×200)Fig.1 Effects of JiangzhiLigan Decoction on liver histopathological changes of rats(×200)

2.3降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表3所示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝臟氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分的影響

圖2 降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of JiangzhiLigan Decoction on NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18 protein expressions of rat liver tissuesNote:A.Normal;B.Model;C.Low dose;D.Middle dose;E.High dose;F.MCC950.

表3 降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響

3 討論

降脂理肝湯中以澤瀉和丹參為主，澤瀉利濕降濁以消脂，丹參活血化瘀理肝；以決明子和海藻為輔，決明子清肝化濁通便，海藻消痰軟堅(jiān)，利水清熱；以郁金為佐，郁金行氣化瘀、通絡(luò)止痛，助丹參活血化瘀疏理肝絡(luò)；以荷葉為使，荷葉升清降濁，共奏氣行郁解、痰化濁降、血活瘀消之功，可有效干預(yù)NAFLD[11]。前期研究表明降脂理肝湯可降低NAFLD大鼠體質(zhì)量、肝重和肝指數(shù)，調(diào)節(jié)脂代謝，改善脂質(zhì)過氧化,降低血清TNF-α含量[13]。本研究進(jìn)一步觀察降脂理肝湯干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠血清ALT和AST水平及肝臟病理形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠血清ALT和AST水平顯著升高，肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積明顯，NAFLD活動(dòng)度評(píng)分明顯升高，提示造模成功；而給予降脂理肝湯干預(yù)后，大鼠ALT和AST水平顯著降低，肝臟病理?yè)p傷減輕，肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積減輕，NAFLD活動(dòng)度評(píng)分顯著降低，且呈濃度依賴性，提示降脂理肝湯可減輕NAFLD大鼠肝臟病理?yè)p傷，改善肝功能，有效治療NAFLD。

前期研究揭示降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制與抗炎、調(diào)控腸道菌群等多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制與炎癥小體有關(guān)[14]。因此本研究進(jìn)一步觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD中NLRP3活化的影響，探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制。研究顯示NLRP3炎癥小體活化于NAFLD中，并介導(dǎo)NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程，是NAFLD干預(yù)的重要靶點(diǎn)[6-10]。活化的NLRP3炎癥小體可使無活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1前體(pro-Caspase-1)轉(zhuǎn)化為有活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1(Caspase-1)，Caspase-1可剪切IL-1β前體和IL-18前體，形成有活性的IL-1β和IL-18，二者促進(jìn)炎癥因子的釋放，引發(fā)病理性炎癥反應(yīng)，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平是評(píng)價(jià)NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵指標(biāo)[15-17]。因此本研究觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平的影響，探討降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化的影響。研究結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高，與既往研究結(jié)論一致[6-10]。提示在NAFLD中存在NLRP3炎癥小體活化。近期研究報(bào)道抑制NAFLD中NLRP3炎癥小體的活化可有效治療NAFLD[6-10]。本研究結(jié)果提示NLRP3特異性抑制劑MCC950可抑制NLRP3炎癥小體活化，降低血清ALT和AST水平，減輕肝臟病理?yè)p傷，減輕肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積，降低NAFLD活動(dòng)度評(píng)分，表明抑制NLRP3炎癥小體活化可有效治療NAFLD。本研究結(jié)果顯示，降脂理肝湯干預(yù)后，降脂理肝湯組中劑量和高劑量大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明降脂理肝湯可抑制NAFLD大鼠肝臟組織NLRP3炎癥小體活化，提示降脂理肝湯可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化治療NAFLD。

綜上所述，降脂理肝湯可有效治療NAFLD，其機(jī)制與抑制NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。