尹抗抗 聶 娟 唐 標

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410028)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝相關(guān)性疾病，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要特征，其疾病譜包括單純性脂肪肝炎及由其演變的NAFLD、肝硬化和肝細胞癌，目前是全球最常見的慢性肝臟疾病[1-3]。NAFLD的發(fā)病機制與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[4,5]。近期研究顯示，NLRP3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的核心部分介導(dǎo)NAFLD發(fā)生發(fā)展，NLRP3活化可加速疾病進展，抑制NLRP3炎癥小體活化可減輕NAFLD炎癥反應(yīng)，延緩疾病進展，NLRP3炎癥小體已成為NAFLD的重要治療靶點[6-10]。

降脂理肝湯是張云鵬教授的臨床經(jīng)驗方劑，由澤瀉、丹參、決明子、郁金、海藻和荷葉6味中藥組成，臨床觀察表明，降脂理肝湯具有調(diào)脂、護肝、減肥等作用，治療NAFLD療效確切[11]。前期實驗研究表明，降脂理肝湯能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠脂代謝，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)整腸道菌群，改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[12,13]。但NLRP3炎癥小體是否介導(dǎo)降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機制尚未明確，因此本研究觀察降脂理肝湯對NAFLD中炎癥小體活化的影響，探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 降脂理肝湯由澤瀉10 g、決明子30 g、丹參10 g、郁金10 g、海藻30 g、荷葉10 g組成，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)陳曉陽教授鑒定符合治療標準。上述藥物加8倍量水浸泡30 min后，沸后煎煮1 h后過濾，再加6倍量水沸后煎煮1 h過濾，兩次藥液混合，于65℃減壓旋蒸濃縮為2 g/ml濃縮液，4℃冷藏儲存，臨用前采用生理鹽水稀釋成所需濃度。高脂飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.1.2實驗動物 健康SPF級SD雄性大鼠75只，體質(zhì)量(150±10)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK(湘)2017-0003。

1.1.3試劑 NLRP3特異性抑制劑MCC950(批號：S7809)購自Selleck公司；水合氯醛(批號：8MQ20-CC)購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Western blot及IP細胞裂解液(批號：P0013)購自碧云天公司；蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，100×DMSO儲液，批號：B14002)、磷酸酶抑制劑Cocktail (100×，批號：B15002)購自Bimake；IL-1β(批號：ab9787)、IL-18 (批號：ab191860)兔抗多克隆抗體購自Abcam；Caspase-1(批號：NBP1-45433)、NLRP3(批號：NBP2-12446)兔抗多克隆抗體購自Novus Bio-logicals；GAPDH兔抗多克隆抗體(批號：G9545)購自Sigma；山羊抗兔二抗(批號：AP132P)購自Merck。

1.1.4儀器 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；LEICADNLB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)；Shandon325石蠟切片機(英國Shandon公司)。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型的建立 高脂飼料喂養(yǎng)12周建立NAFLD大鼠模型[12，13]。高脂飼料配方：脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%、標準大鼠飼料82.5%。

1.2.2動物分組和藥物干預(yù) SD大鼠隨機分為正常組、模型組、降脂理肝湯組和NLRP3特異性抑制劑MCC950組，其中降脂理肝湯給藥劑量參照前期研究，按照動物與人體間的等效劑量換算，設(shè)3個劑量，分別為降脂理肝湯低劑量組(2.3 g/kg)、降脂理肝湯中劑量組(4.6 g/kg)和降脂理肝湯高劑量組(9.2 g/kg)[12,13]。MCC950給藥劑量參照文獻[7]為10 mg/kg。正常組標準飼料喂養(yǎng)，模型組和降脂理肝湯高脂飼料喂養(yǎng)12周后，每組隨機抽取3只，取肝組織進行HE染色，觀察組織病理學(xué)變化，觀察到高脂飼料小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的脂肪變性和空泡樣變，表示模型成功。灌胃給予降脂理肝湯和MCC950，1次/d，連續(xù)6周，每周稱重1次，按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，藥物干預(yù)期間，喂養(yǎng)方式同1.2.1。干預(yù)結(jié)束后，取各組大鼠血液和肝臟待測。

1.2.3血清ALT和AST水平檢測 將全血以3 000 r/min 離心10 min后，吸取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清 ALT和AST水平。

1.2.4肝組織HE染色及肝臟病理學(xué)改變評分 取各組大鼠同位段肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗1～2次，濾紙吸干后置于4%多聚甲醛中固定。將組織進行石蠟包埋，切4 μm厚片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上進行常規(guī)HE染色。封片后光鏡下觀察各組大鼠子宮病理變化情況并進行氣球樣變評分和NAFLD活動度評分，評分標準參照美國國立衛(wèi)生研究院非酒精性脂肪性肝炎臨床研究病理工作組指南。

1.2.5Western blot 每組選取5只大鼠，取大鼠同部位肝臟組織100 mg，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液1 ml于冰上混勻30 min，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NLRP3 (1∶1 000)、Caspase-1 (1∶500)、IL-1β (1∶1 000)、IL-18 (1∶1 000)和GAPDH (1∶5 000)一抗4℃孵育過夜，洗滌后加HRP標記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育l h，洗滌后ECL顯色曝光，Quantity One灰度分析軟件進行圖像定量分析，測定目的蛋白的相對光密度值(IOD)，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白IOD與內(nèi)參蛋白IOD比值，以此表示蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1降脂理肝湯對NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠血清ALT水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，降脂理肝湯各組和MCC950組大鼠血清AST水平顯著降低，且各劑量組呈濃度依賴性(P<0.01)。見表1。

2.2降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 HE染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞呈多邊形,核大而圓,位于肝細胞中央，偶見肝組織脂肪變性，肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細胞浸潤，無纖維組織增生；模型組大鼠肝細胞排列紊亂,伴有氣球樣變,炎癥細胞浸潤，肝臟脂肪變性明顯，可見肝細胞腫大變圓,內(nèi)有巨大脂肪滴,未見肝纖維化及肝硬化；各藥物組均有不同程度脂肪變性,但相較于模型組明顯減輕,氣球樣變減少，見圖1。如圖2、表3所示，與正常組相比，模型組小鼠氣球樣變評分和NAFLD活動度評分顯著升高(P<0.01)，而降脂理肝湯各劑量組和MCC950組評分顯著降低，且呈濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 降脂理肝湯對大鼠血清ALT和AST水平的影響

圖1 降脂理肝湯對大鼠肝臟病理組織學(xué)改變的影響(×200)Fig.1 Effects of JiangzhiLigan Decoction on liver histopathological changes of rats(×200)

2.3降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達的影響 如圖2、表3所示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 降脂理肝湯對大鼠肝臟氣球樣變評分和NAFLD活動度評分的影響

圖2 降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達的影響Fig.2 Effects of JiangzhiLigan Decoction on NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18 protein expressions of rat liver tissuesNote:A.Normal;B.Model;C.Low dose;D.Middle dose;E.High dose;F.MCC950.

表3 降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達的影響

3 討論

降脂理肝湯中以澤瀉和丹參為主，澤瀉利濕降濁以消脂，丹參活血化瘀理肝；以決明子和海藻為輔，決明子清肝化濁通便，海藻消痰軟堅，利水清熱；以郁金為佐，郁金行氣化瘀、通絡(luò)止痛，助丹參活血化瘀疏理肝絡(luò)；以荷葉為使，荷葉升清降濁，共奏氣行郁解、痰化濁降、血活瘀消之功，可有效干預(yù)NAFLD[11]。前期研究表明降脂理肝湯可降低NAFLD大鼠體質(zhì)量、肝重和肝指數(shù)，調(diào)節(jié)脂代謝，改善脂質(zhì)過氧化,降低血清TNF-α含量[13]。本研究進一步觀察降脂理肝湯干預(yù)對NAFLD大鼠血清ALT和AST水平及肝臟病理形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠血清ALT和AST水平顯著升高，肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積明顯，NAFLD活動度評分明顯升高，提示造模成功；而給予降脂理肝湯干預(yù)后，大鼠ALT和AST水平顯著降低，肝臟病理損傷減輕，肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積減輕，NAFLD活動度評分顯著降低，且呈濃度依賴性，提示降脂理肝湯可減輕NAFLD大鼠肝臟病理損傷，改善肝功能，有效治療NAFLD。

前期研究揭示降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機制與抗炎、調(diào)控腸道菌群等多個環(huán)節(jié)有關(guān)，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機制與炎癥小體有關(guān)[14]。因此本研究進一步觀察降脂理肝湯對NAFLD中NLRP3活化的影響，探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機制。研究顯示NLRP3炎癥小體活化于NAFLD中，并介導(dǎo)NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程，是NAFLD干預(yù)的重要靶點[6-10]。活化的NLRP3炎癥小體可使無活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1前體(pro-Caspase-1)轉(zhuǎn)化為有活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1(Caspase-1)，Caspase-1可剪切IL-1β前體和IL-18前體，形成有活性的IL-1β和IL-18，二者促進炎癥因子的釋放，引發(fā)病理性炎癥反應(yīng)，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平是評價NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵指標[15-17]。因此本研究觀察降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平的影響，探討降脂理肝湯對NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化的影響。研究結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)后，大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平顯著升高，與既往研究結(jié)論一致[6-10]。提示在NAFLD中存在NLRP3炎癥小體活化。近期研究報道抑制NAFLD中NLRP3炎癥小體的活化可有效治療NAFLD[6-10]。本研究結(jié)果提示NLRP3特異性抑制劑MCC950可抑制NLRP3炎癥小體活化，降低血清ALT和AST水平，減輕肝臟病理損傷，減輕肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積，降低NAFLD活動度評分，表明抑制NLRP3炎癥小體活化可有效治療NAFLD。本研究結(jié)果顯示，降脂理肝湯干預(yù)后，降脂理肝湯組中劑量和高劑量大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平顯著降低，表明降脂理肝湯可抑制NAFLD大鼠肝臟組織NLRP3炎癥小體活化，提示降脂理肝湯可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化治療NAFLD。

綜上所述，降脂理肝湯可有效治療NAFLD，其機制與抑制NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。