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        降脂理肝湯抑制NLRP3炎癥小體活化減輕高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝?、?/h1>
        2020-12-23 12:38:36尹抗抗
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年22期
        關(guān)鍵詞:降脂高脂批號(hào)

        尹抗抗 聶 娟 唐 標(biāo)

        (湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410028)

        非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝相關(guān)性疾病,以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要特征,其疾病譜包括單純性脂肪肝炎及由其演變的NAFLD、肝硬化和肝細(xì)胞癌,目前是全球最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病[1-3]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[4,5]。近期研究顯示,NLRP3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的核心部分介導(dǎo)NAFLD發(fā)生發(fā)展,NLRP3活化可加速疾病進(jìn)展,抑制NLRP3炎癥小體活化可減輕NAFLD炎癥反應(yīng),延緩疾病進(jìn)展,NLRP3炎癥小體已成為NAFLD的重要治療靶點(diǎn)[6-10]。

        降脂理肝湯是張?jiān)迄i教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑,由澤瀉、丹參、決明子、郁金、海藻和荷葉6味中藥組成,臨床觀察表明,降脂理肝湯具有調(diào)脂、護(hù)肝、減肥等作用,治療NAFLD療效確切[11]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明,降脂理肝湯能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠脂代謝,抑制炎癥反應(yīng),調(diào)整腸道菌群,改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[12,13]。但NLRP3炎癥小體是否介導(dǎo)降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制尚未明確,因此本研究觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD中炎癥小體活化的影響,探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1藥物 降脂理肝湯由澤瀉10 g、決明子30 g、丹參10 g、郁金10 g、海藻30 g、荷葉10 g組成,中藥飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)陳曉陽(yáng)教授鑒定符合治療標(biāo)準(zhǔn)。上述藥物加8倍量水浸泡30 min后,沸后煎煮1 h后過(guò)濾,再加6倍量水沸后煎煮1 h過(guò)濾,兩次藥液混合,于65℃減壓旋蒸濃縮為2 g/ml濃縮液,4℃冷藏儲(chǔ)存,臨用前采用生理鹽水稀釋成所需濃度。高脂飼料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

        1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠75只,體質(zhì)量(150±10)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(湘)2017-0003。

        1.1.3試劑 NLRP3特異性抑制劑MCC950(批號(hào):S7809)購(gòu)自Selleck公司;水合氯醛(批號(hào):8MQ20-CC)購(gòu)自梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;Western blot及IP細(xì)胞裂解液(批號(hào):P0013)購(gòu)自碧云天公司;蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA,100×DMSO儲(chǔ)液,批號(hào):B14002)、磷酸酶抑制劑Cocktail (100×,批號(hào):B15002)購(gòu)自Bimake;IL-1β(批號(hào):ab9787)、IL-18 (批號(hào):ab191860)兔抗多克隆抗體購(gòu)自Abcam;Caspase-1(批號(hào):NBP1-45433)、NLRP3(批號(hào):NBP2-12446)兔抗多克隆抗體購(gòu)自Novus Bio-logicals;GAPDH兔抗多克隆抗體(批號(hào):G9545)購(gòu)自Sigma;山羊抗兔二抗(批號(hào):AP132P)購(gòu)自Merck。

        1.1.4儀器 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);LEICADNLB2型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司);Shandon325石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon公司)。

        1.2方法

        1.2.1NAFLD大鼠模型的建立 高脂飼料喂養(yǎng)12周建立NAFLD大鼠模型[12,13]。高脂飼料配方:脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%、標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料82.5%。

        1.2.2動(dòng)物分組和藥物干預(yù) SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、降脂理肝湯組和NLRP3特異性抑制劑MCC950組,其中降脂理肝湯給藥劑量參照前期研究,按照動(dòng)物與人體間的等效劑量換算,設(shè)3個(gè)劑量,分別為降脂理肝湯低劑量組(2.3 g/kg)、降脂理肝湯中劑量組(4.6 g/kg)和降脂理肝湯高劑量組(9.2 g/kg)[12,13]。MCC950給藥劑量參照文獻(xiàn)[7]為10 mg/kg。正常組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),模型組和降脂理肝湯高脂飼料喂養(yǎng)12周后,每組隨機(jī)抽取3只,取肝組織進(jìn)行HE染色,觀察組織病理學(xué)變化,觀察到高脂飼料小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的脂肪變性和空泡樣變,表示模型成功。灌胃給予降脂理肝湯和MCC950,1次/d,連續(xù)6周,每周稱重1次,按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水,藥物干預(yù)期間,喂養(yǎng)方式同1.2.1。干預(yù)結(jié)束后,取各組大鼠血液和肝臟待測(cè)。

        1.2.3血清ALT和AST水平檢測(cè) 將全血以3 000 r/min 離心10 min后,吸取血清,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清 ALT和AST水平。

        1.2.4肝組織HE染色及肝臟病理學(xué)改變?cè)u(píng)分 取各組大鼠同位段肝臟組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗1~2次,濾紙吸干后置于4%多聚甲醛中固定。將組織進(jìn)行石蠟包埋,切4 μm厚片,固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上進(jìn)行常規(guī)HE染色。封片后光鏡下觀察各組大鼠子宮病理變化情況并進(jìn)行氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院非酒精性脂肪性肝炎臨床研究病理工作組指南。

        1.2.5Western blot 每組選取5只大鼠,取大鼠同部位肝臟組織100 mg,加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液1 ml于冰上混勻30 min,提取組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入NLRP3 (1∶1 000)、Caspase-1 (1∶500)、IL-1β (1∶1 000)、IL-18 (1∶1 000)和GAPDH (1∶5 000)一抗4℃孵育過(guò)夜,洗滌后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000),室溫孵育l h,洗滌后ECL顯色曝光,Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行圖像定量分析,測(cè)定目的蛋白的相對(duì)光密度值(IOD),以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白IOD與內(nèi)參蛋白IOD比值,以此表示蛋白表達(dá)水平。

        2 結(jié)果

        2.1降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠血清ALT水平顯著降低(P<0.05或P<0.01),降脂理肝湯各組和MCC950組大鼠血清AST水平顯著降低,且各劑量組呈濃度依賴性(P<0.01)。見(jiàn)表1。

        2.2降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 HE染色顯示,正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝細(xì)胞呈多邊形,核大而圓,位于肝細(xì)胞中央,偶見(jiàn)肝組織脂肪變性,肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)纖維組織增生;模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,伴有氣球樣變,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肝臟脂肪變性明顯,可見(jiàn)肝細(xì)胞腫大變圓,內(nèi)有巨大脂肪滴,未見(jiàn)肝纖維化及肝硬化;各藥物組均有不同程度脂肪變性,但相較于模型組明顯減輕,氣球樣變減少,見(jiàn)圖1。如圖2、表3所示,與正常組相比,模型組小鼠氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分顯著升高(P<0.01),而降脂理肝湯各劑量組和MCC950組評(píng)分顯著降低,且呈濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

        表1 降脂理肝湯對(duì)大鼠血清ALT和AST水平的影響

        圖1 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝臟病理組織學(xué)改變的影響(×200)Fig.1 Effects of JiangzhiLigan Decoction on liver histopathological changes of rats(×200)

        2.3降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表3所示,與正常組相比,模型組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,降脂理肝湯4.6、9.2 g/kg組和MCC950組大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

        表2 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝臟氣球樣變?cè)u(píng)分和NAFLD活動(dòng)度評(píng)分的影響

        圖2 降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of JiangzhiLigan Decoction on NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18 protein expressions of rat liver tissuesNote:A.Normal;B.Model;C.Low dose;D.Middle dose;E.High dose;F.MCC950.

        表3 降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響

        3 討論

        降脂理肝湯中以澤瀉和丹參為主,澤瀉利濕降濁以消脂,丹參活血化瘀理肝;以決明子和海藻為輔,決明子清肝化濁通便,海藻消痰軟堅(jiān),利水清熱;以郁金為佐,郁金行氣化瘀、通絡(luò)止痛,助丹參活血化瘀疏理肝絡(luò);以荷葉為使,荷葉升清降濁,共奏氣行郁解、痰化濁降、血活瘀消之功,可有效干預(yù)NAFLD[11]。前期研究表明降脂理肝湯可降低NAFLD大鼠體質(zhì)量、肝重和肝指數(shù),調(diào)節(jié)脂代謝,改善脂質(zhì)過(guò)氧化,降低血清TNF-α含量[13]。本研究進(jìn)一步觀察降脂理肝湯干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠血清ALT和AST水平及肝臟病理形態(tài)的影響,結(jié)果顯示,高脂飲食喂養(yǎng)后,大鼠血清ALT和AST水平顯著升高,肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積明顯,NAFLD活動(dòng)度評(píng)分明顯升高,提示造模成功;而給予降脂理肝湯干預(yù)后,大鼠ALT和AST水平顯著降低,肝臟病理?yè)p傷減輕,肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積減輕,NAFLD活動(dòng)度評(píng)分顯著降低,且呈濃度依賴性,提示降脂理肝湯可減輕NAFLD大鼠肝臟病理?yè)p傷,改善肝功能,有效治療NAFLD。

        前期研究揭示降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制與抗炎、調(diào)控腸道菌群等多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān),且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制與炎癥小體有關(guān)[14]。因此本研究進(jìn)一步觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD中NLRP3活化的影響,探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制。研究顯示NLRP3炎癥小體活化于NAFLD中,并介導(dǎo)NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,是NAFLD干預(yù)的重要靶點(diǎn)[6-10]?;罨腘LRP3炎癥小體可使無(wú)活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1前體(pro-Caspase-1)轉(zhuǎn)化為有活性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶1(Caspase-1),Caspase-1可剪切IL-1β前體和IL-18前體,形成有活性的IL-1β和IL-18,二者促進(jìn)炎癥因子的釋放,引發(fā)病理性炎癥反應(yīng),NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平是評(píng)價(jià)NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵指標(biāo)[15-17]。因此本研究觀察降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平的影響,探討降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化的影響。研究結(jié)果顯示,高脂飲食喂養(yǎng)后,大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高,與既往研究結(jié)論一致[6-10]。提示在NAFLD中存在NLRP3炎癥小體活化。近期研究報(bào)道抑制NAFLD中NLRP3炎癥小體的活化可有效治療NAFLD[6-10]。本研究結(jié)果提示NLRP3特異性抑制劑MCC950可抑制NLRP3炎癥小體活化,降低血清ALT和AST水平,減輕肝臟病理?yè)p傷,減輕肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積,降低NAFLD活動(dòng)度評(píng)分,表明抑制NLRP3炎癥小體活化可有效治療NAFLD。本研究結(jié)果顯示,降脂理肝湯干預(yù)后,降脂理肝湯組中劑量和高劑量大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低,表明降脂理肝湯可抑制NAFLD大鼠肝臟組織NLRP3炎癥小體活化,提示降脂理肝湯可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體活化治療NAFLD。

        綜上所述,降脂理肝湯可有效治療NAFLD,其機(jī)制與抑制NAFLD大鼠NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。

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