胡 斌 陳 光 褚海偉 朱碧芳

下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans of the lower limbs，ASO）是由于下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊導(dǎo)致動(dòng)脈管腔變窄，出現(xiàn)下肢缺血癥狀的疾病[1]，隨著人口老齡化，ASO 的發(fā)病率和死亡率逐年增高，嚴(yán)重威脅人類健康。下肢動(dòng)脈經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTA）+支架植入術(shù)（STENT）是ASO 的重要治療手段，但術(shù)后有較高比例的患者發(fā)生動(dòng)脈再狹窄，嚴(yán)重影響PTA+STENT 術(shù)的療效和患者的長(zhǎng)期預(yù)后[2]。研究顯示，SMAD7 在抗血管壁纖維化，緩解動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3]。本研究旨在探究SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)多態(tài)性與下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015 年7 月—2019 年6 月于浙江省臺(tái)州醫(yī)院血管外科接受下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)患者200 例為研究對(duì)象，以術(shù)后9 個(gè)月出現(xiàn)動(dòng)脈再狹窄90 例為觀察組，未出現(xiàn)再狹窄110 例為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，符合《赫爾辛基宣言》倫理原則。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）CT 血管造影檢測(cè)顯示，動(dòng)脈狹窄程度≥50%為ASO 及動(dòng)脈再狹窄判定標(biāo)準(zhǔn)[4]，符合PTA+STENT 手術(shù)指征[5]；（2）臨床資料完整；（3）患者及其家屬同意并簽訂知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）并發(fā)繼發(fā)性高血壓；（2）有主動(dòng)脈手術(shù)史者；（3）有肺或結(jié)締組織病、心肌病、充血性心力衰竭、先天性心臟病、感染性心內(nèi)膜炎、風(fēng)濕性心臟病者；（4）癌癥、梅毒患者；（5）合并中、重度瓣膜病變；（6）糖尿病和腎功能不全者。

1.4 主要試劑及儀器 SMAD7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)JS12168）購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司；基因組DNA 抽提試劑盒（批號(hào)D2100-50T）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)LABOSPECT 008AS，日本日立公司）、全自動(dòng)核酸分析儀（型號(hào)MultiNA，上海諾晶生物科技有限公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)Mutiskan Go，美國(guó)Thermo 公司）、離心機(jī)（型號(hào)Megfuge 1.0，德國(guó)Heraeus 公司）。

1.5 PTA+STENT 術(shù) 所有患者行局部或全身麻醉，股靜脈穿刺后給予5000U 肝素，造影明確下肢動(dòng)脈狹窄段，球囊擴(kuò)張，支架植入，再次造影判斷手術(shù)是否成功[6]。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 ELISA 法測(cè)定兩組患者血清SMAD7 表達(dá)所有患者術(shù)后9 個(gè)月采集5mL 外周血，分離血清，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肊LISA 法檢測(cè)兩組患者血清SMAD7 水平，將-80℃的血清于室溫下解凍，分別將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血清和抗體各50μL 加入反應(yīng)孔中，震蕩混勻后，37℃孵育1h，棄去各孔液體，洗滌后，每孔加親和鏈酶素-HRP 80μL，混勻、37℃孵育30min，清洗后，每孔加A、B 底物各50μL，37℃孵育10min，加入終止液后，于450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)的濃度。

1.6.2 兩組患者血脂水平檢測(cè) 檢測(cè)兩組患者血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、尿酸水平。血清總膽固醇用膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法酶（CHOD-PAP）法檢測(cè)，三酰甘油用甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶（GPO-PAP）法檢測(cè)，低、高密度脂蛋白膽固醇用均相法檢測(cè)，尿酸用尿酸酶比色法檢測(cè)。

1.6.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP） 聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。基因組DNA 抽提：按照試劑盒操作說(shuō)明抽提基因組DNA，適量雙蒸水溶解，核酸分析儀測(cè)定DNA 濃度，-80℃保存。取A260/280 比值為1.7～2.0 的DNA 標(biāo)本用于后續(xù)PCR-RFLP 基因分型研究。根據(jù)Genebank基因庫(kù)序列信息，在SMAD7 基因的rs4939827 多態(tài)位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。引物由上海捷瑞生物公司合成。rs4939827 多態(tài)位點(diǎn)引物序列：AT：ATGCTCACAGCCTCATCCAAAAGAGGAAAT；TG：ACCATGCTCACAGCCTCATCCAAAAGAGGAAAC；TR：-p-TTCATCCTTCTCTGTCTGTTCC-FAM-。PCR 擴(kuò)增獲得特異性產(chǎn)物：取適量PCR 產(chǎn)物行限制性內(nèi)切酶消化，37℃溫育16h，終止酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，EB 染色，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。測(cè)序測(cè)定：對(duì)其中部分基因型的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收，過(guò)柱純化，送上海生工生物公司作DNA 測(cè)序驗(yàn)證。

1.6.4 兩組患者血管管腔直徑狹窄程度檢測(cè) 兩組患者分別與術(shù)前、術(shù)后、術(shù)后9 個(gè)月行CT 血管造影檢測(cè)血管管腔直徑狹窄度[7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic 多因素回歸分析PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、糖尿病史等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者一般資料比較

2.2 術(shù)后兩組患者血脂水平比較 兩組患者三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、尿酸水平均無(wú)明顯差異（P＞0.05），觀察組總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組患者血管管腔直徑狹窄程度比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者術(shù)前、術(shù)后血管管腔直徑狹窄程度無(wú)顯著差異（P＞0.05），術(shù)后9 個(gè)月血管管腔直徑再狹窄程度顯著升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 兩組患者血清SMAD7 表達(dá)水平比較 術(shù)后9個(gè)月后，對(duì)照組血清中SMAD7 表達(dá)水平為（200.59±18.76）mmol/L，觀察組為（118.34±10.48）mmol/L，與對(duì)照組比較，觀察組患者血清SMAD7 表達(dá)水平顯著下降（t=37.114，P=0.000）。

2.5 兩組患者SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)等位基因和基因型頻率比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)C 等位基因和CC 基因型頻率顯著升高（P＜0.05），T 等位基因、TT 基因型頻率顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表2 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者血脂水平比較（mmol/L，）

表2 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者血脂水平比較（mmol/L，）

注：觀察組為PTA+STENT 術(shù)后9 個(gè)月出現(xiàn)動(dòng)脈再狹窄者；對(duì)照組為PTA+STENT 術(shù)后9 個(gè)月未出現(xiàn)動(dòng)脈再狹窄者；PTA+STENT 為經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)+支架植入術(shù)

表3 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者血管管腔直徑狹窄程度比較（%，）

表3 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者血管管腔直徑狹窄程度比較（%，）

注：觀察組為PTA+STENT 術(shù)后9 個(gè)月出現(xiàn)動(dòng)脈再狹窄者；對(duì)照組為PTA+STENT 術(shù)后9 個(gè)月未出現(xiàn)動(dòng)脈再狹窄者；PTA+STENT 為經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)+支架植入術(shù)

表4 兩組下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)等位基因和基因型頻率比較[例（%）]

2.6 PTA+STENT 術(shù)后再狹窄危險(xiǎn)因素分析 Logistic 回歸分析顯示，血清中總膽固醇＞4.85mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇＞2.81mmol/L、血清SMAD7 水平＜118.34mmol/L（根據(jù)檢測(cè)總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血清SMAD7 水平的平均值進(jìn)行分組）、SMAD7基因rs4939827 位點(diǎn)CC 基因型為PTA+STENT 術(shù)后動(dòng)脈再狹窄的危險(xiǎn)因素（P ＜0.05），SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)TT 基因型為保護(hù)因素（P＜0.05）。見表5。

3 討論

下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，動(dòng)脈硬化的發(fā)展進(jìn)程、血管內(nèi)膜增生及損傷、血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移等因素與ASO 術(shù)后再狹窄的發(fā)生密切相關(guān)[8]。盧靜等[9]研究顯示，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血清總膽固醇未下降，低密度脂蛋白膽固醇未達(dá)標(biāo)，與術(shù)后再狹窄呈正相關(guān)，是術(shù)后再狹窄發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組患者術(shù)后血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平、血管管腔直徑再狹窄程度顯著升高（P＜0.05），提示患者血清膽固醇、低密度膽固醇水平可能與下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的發(fā)生有關(guān)。

血管中平滑肌細(xì)胞增殖、遷移參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維化的生成，推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[10]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是一種多效性生長(zhǎng)因子，通過(guò)與其受體結(jié)合可以激活SMADs 信號(hào)傳導(dǎo)參與組織纖維化過(guò)程[11]。SMAD7 屬于SMADs 家族，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGF-β-SMAD 的靶基因，SMAD7 可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用抑制或破壞TGF-β誘導(dǎo)的功能性Smad-DNA 形成，抑制細(xì)胞中TGF-β/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)[12]。研究顯示，SMAD7 表達(dá)失調(diào)與組織纖維化、炎性疾病以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[13]。Lee 等人[14]研究顯示，SMAD7 過(guò)表達(dá)可以抑制TGF-β/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)減少組織纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組患者術(shù)后血清SMAD7 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），提示其可能與下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的發(fā)生有關(guān)。

SMAD7 基因位于染色體18p22.1，研究顯示SMAD7 多態(tài)性（rs4464148，rs4939827 和rs12953717）與大腸癌、肝癌等癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，Akbari 等[15]研究顯示，rs4939827 的T 等位基因、rs4464148 的C等位基因、rs12953717 的T 等位基因均與大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。Zhang 等[16]研究顯示，SMAD7 多態(tài)性突變?cè)趓s4939827 位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生CC 和TT 兩種基因型，在大腸癌中CC 基因型的rs4939827 是一種保護(hù)性基因型，可以抑制SMAD7 基因的正確表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖。上述研究結(jié)果提示，CC 基因型的rs4939827 抑制SMAD7 表達(dá)，SMAD7 蛋白與TGF-β結(jié)合，導(dǎo)致其泛素化和破壞，從而抑制TGF-β 促纖維作用，推測(cè)CC 基因型的rs4939827 可能參與下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組患者SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)C 等位基因和CC 基因型頻率顯著升高，T 等位基因、TT 基因型頻率顯著降低（P＜0.05），提示SMAD7基因rs4939827 位點(diǎn)基因型與下肢動(dòng)脈PTA+STENT術(shù)后再狹窄有關(guān)。楊珍珍等[17]研究顯示，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后，血脂控制不佳（TC 較術(shù)前未下降、LDL-C 未達(dá)標(biāo)）是支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究進(jìn)一步Logistic 回歸分析顯示，血清總膽固醇＞4.85mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇＞2.81mmol/L、血清SMAD7 水平＜118.34ng/mL、SMAD7 基因rs4939827位點(diǎn)CC 基因型為下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄的危險(xiǎn)因素，SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)TT 基因型為下肢動(dòng)脈PTA+STENT 再狹窄的保護(hù)因素，提示血脂水平、血清SMAD7 水平、SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)基因型均影響下肢動(dòng)脈PTA+STENT術(shù)后再狹窄的發(fā)生。

表5 下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者PTA+STENT 術(shù)后再狹窄危險(xiǎn)因素Logistic 回歸分析結(jié)果

綜上所述，SMAD7 基因rs4939827 位點(diǎn)CC 基因型和TT 基因型與下肢動(dòng)脈PTA+STENT 術(shù)后再狹窄有關(guān)。