范敏慧 何曉其 吳亞萍

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大最常被診斷的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。放化療及靶向藥物索拉非尼、倉伐替尼是目前HCC 的主要治療方法，但HCC 患者的總體預(yù)后仍然不理想[2-3]。研究表明，甘草可通過抑制肝癌增殖、遷移和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多條途徑抑制原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展，并在肝癌介入放療患者中有重要的保護(hù)作用[4-6]。新甘草酚是甘草酚類單體的組分之一[7]，本研究探討新甘草酚對人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞增殖的影響和機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株 HepG2 人肝癌細(xì)胞購自ATCC（ATCC HB-8065TM，貨號：a263215）。

1.2 試 劑 高糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號2651）、胎牛血清（批號54685）購自美國Sigma 公司；新甘草酚（批號74874）購自南京道斯夫生物科技有限公司；pan-Akt 激酶抑制劑Capivasertib（批號215451）購自上海藍(lán)木化工有限公司；索拉非尼（批號BXHR3E2，規(guī)格0.2g）購自德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司；CCK8 試劑盒（批號25691）、流式細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號457845）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA simple 總RNA 提取試劑盒（批號453226）購自天根生化科技（北京）有限公司；RIPA中裂解液（批號165212）、蛋白酶抑制劑（批號15441）、磷酸酶抑制劑（批號92659）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸肌醇3 激酶（PI3K）兔單抗（批號87675）、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）兔單抗（批號6258）購自美國abcam 公司；蛋白激酶B（Akt）兔單抗（批號1864）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）兔單抗（批號674564）購自美國CST 公司。

1.3 儀 器 VE 680 微型垂直電泳設(shè)備，上海天能科技有限公司；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國LI-COR 公司；CelMate 二氧化碳培養(yǎng)箱，Esco Lifesciences，新加坡藝思高科技有限公司；FACSAriaTMⅢ流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；酶標(biāo)儀SpectraMax 5，美谷分子儀器（上海）有限公司；HerasafeTM2030i Biological Safety Cabinets 生物安全柜，美國賽默飛公司；CFX96 Touch 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，BIO-RAD 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；-80℃超低溫冰箱，美國賽默飛公司。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 HepG2 人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)方式：含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時傳代。細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白免疫印記（WB）實驗分為空白對照組、新甘草酚低（10μmol/L）、中（20μmol/L）、高劑量組（40μmol/L）、索拉非尼組（10μmol/L）。新甘草酚、索拉非尼分別加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解備用。各組分別加入相應(yīng)藥物、空白對照組以PBS 處理細(xì)胞24h。Akt 抑制劑實驗分為對照組（DMSO），pan-Akt抑制劑組（20μmol/L），Capivasertib 用DMSO 溶解備用。相應(yīng)藥物處理12h 提取細(xì)胞RNA 進(jìn)行RT-PCR實驗。

2.2 CCK8 細(xì)胞增殖實驗 將HepG2 細(xì)胞以1 萬細(xì)胞/孔鋪板于96 孔板，每組5 個復(fù)孔，鋪板12h 后按2.1 分組處理，處理24h 加入CCK8 試劑10μL，2h 后利用酶標(biāo)儀檢測450nm 波長處吸光度值，以空白對照組24h 吸光度值為內(nèi)參，計算細(xì)胞活力相對百分率。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將HepG2 細(xì)胞以40%密度鋪板于6 孔板中，鋪板12h 后按2.1 分組處理24h，消化細(xì)胞至EP 管中按照流式細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作，最后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，記錄儀器各細(xì)胞周期百分率。

2.4 RT-PCR 檢測cyclin D1、cyclin A 表達(dá) HepG2細(xì)胞鋪板后按2.1 分組，其中空白對照組、新甘草酚低、中、高劑量組、索拉非尼組處理細(xì)胞24h，Akt 抑制劑實驗對照組、pan-Akt 抑制劑組處理細(xì)胞12h。按照RNAsimple 總RNA 提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA 后進(jìn)行RT-PCR，PCR 引物如下：cyclin D1（正向引物：5'-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3'；反向引物：5'-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3'）、cyclin A（正向引物：5'-CCTGCGCGAGAAGGAACTG-3'；反向引物：5'-CGTTGTAGCGATCCATGAAGTG-3'）。RT-PCR 程序：變性，95℃，30s；退火，60℃，30s；延伸，72℃，30s。以GAPDH 作為內(nèi)參，通過循環(huán)數(shù)計算各基因mRNA 表達(dá)情況。引物均購自蘇州金唯智生物科技有限公司。

2.5 WB 檢測PI3K-Akt 信號活化 HepG2 細(xì)胞按2.1 分組處理24h 后，取出細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗1 遍后，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30min 后，轉(zhuǎn)移至EP 管中，經(jīng)離心后取上清測定蛋白濃度。定量至1μg/μL，蛋白跑電泳上樣20μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后，4℃孵育一抗過夜，第二天洗去一抗后室溫孵育熒光二抗1h。Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 新甘草酚有效抑制HepG2 細(xì)胞增殖 CCK8 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，新甘草酚低、中、高劑量組對HepG2 細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與索拉非尼組比較，低、中劑量新甘草酚組HepG2 細(xì)胞增殖的抑制效果降低（P＜0.05），而高劑量新甘草酚組HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用與索拉非尼組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組HepG2 細(xì)胞活力百分率比較（%，）

表1 各組HepG2 細(xì)胞活力百分率比較（%，）

注：空白對照組為PBS 處理細(xì)胞；索拉非尼組為索拉非尼（10μmol/L）處理細(xì)胞；新甘草酚低、中、高劑量組分別為10、20、40μmol/L 新甘草酚處理細(xì)胞；與空白對照組比較，aP＜0.05；與索拉非尼組比較，bP＜0.05

3.2 新甘草酚對HepG2 細(xì)胞周期的抑制作用 細(xì)胞周期研究顯示，與空白對照組比較，新甘草酚低、中、高劑量組G0/G1 期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），而中、高劑量組G2/M 期細(xì)胞明顯增加（P＜0.05），表明中、高劑量組新甘草酚明顯抑制HepG2 細(xì)胞DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的過程。與索拉非尼組比較，高劑量組G0/G1 期細(xì)胞減少，G2/M 期細(xì)胞增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組HepG2 細(xì)胞周期百分率比較（%，）

表2 各組HepG2 細(xì)胞周期百分率比較（%，）

注：空白對照組為PBS 處理細(xì)胞；索拉非尼組為索拉非尼（10μmol/L）處理細(xì)胞；新甘草酚低、中、高劑量組分別為10、20、40μmol/L 新甘草酚處理細(xì)胞；與空白對照組比較，aP＜0.05；與索拉非尼組比較，bP＜0.05

3.3 新甘草酚抑制細(xì)胞增殖標(biāo)志物cyclin D1、cyclin A 表達(dá) RT-PCR 檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin A 的表達(dá)實驗顯示，與空白對照組比較，新甘草酚中、高劑量組對cyclin D1、cyclin A mRNA 的表達(dá)均具有明顯抑制作用（P＜0.05）。與索拉非尼組比較，新甘草酚中劑量組對cyclin D1、cyclin A 抑制作用相對降低（P＜0.05），而高劑量組抑制作用與索拉非尼組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3.4 新甘草酚抑制PI3K-Akt 信號 WB 實驗顯示，與空白對照組比較，索拉非尼組及新甘草酚低、中、高劑量組對p-PI3K、p-Akt 的磷酸化水平均具有明顯的抑制作用。應(yīng)用pan-Akt 激酶抑制劑Capi-vasertib 處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，pan-Akt 抑制劑組cyclin D1 mRNA 表達(dá)明顯降低。表明新甘草酚可能通過PI3K-Akt 信號抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。見圖1、表4。

表3 各組HepG2 細(xì)胞cyclin D1、cyclin A mRNA相對表達(dá)量比較（）

表3 各組HepG2 細(xì)胞cyclin D1、cyclin A mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：空白對照組為PBS 處理細(xì)胞；索拉非尼組為索拉非尼（10μmol/L）處理細(xì)胞；新甘草酚低、中、高劑量組分別為10、20、40μmol/L 新甘草酚處理細(xì)胞；cyclin D1 為細(xì)胞周期蛋白D1；cyclin A 為細(xì)胞周期蛋白A；與空白對照組比較，aP＜0.05；與索拉非尼組比較，bP＜0.05

圖1 新甘草酚對PI3K-Akt 信號的影響

表4 各組cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)量比較（）

表4 各組cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)量比較（）

注：對照組為DMSO 處理細(xì)胞；pan-Akt 抑制劑組為Capivasertib（20μmol/L）處理細(xì)胞；cyclin D1 為細(xì)胞周期蛋白D1；與對照組比較，aP＜0.05

4 討論

研究顯示，中藥甘草有效成分體外能有效誘導(dǎo)多種肝癌細(xì)胞凋亡[8]，目前已有復(fù)方甘草甜素應(yīng)用于臨床治療原發(fā)性肝癌的報道[9]，提示甘草在肝癌的防治中具有重要的作用。甘草酚是近來發(fā)現(xiàn)的一種甘草的有效單體成分。本研究中CCK8 細(xì)胞活力檢測表明，新甘草酚能有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2 增殖（P＜0.05）。細(xì)胞周期實驗發(fā)現(xiàn)，新甘草酚處理HepG2細(xì)胞后，G2/M 期細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.05），而G0/G1 期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.05）。提示新甘草酚通過調(diào)控肝癌細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖。Cyclin D1、cyclin A 是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵分子[10]。本研究通過RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)新甘草酚明顯降低了cyclin D1、cyclin A mRNA 的表達(dá)（P＜0.05）。提示新甘草酚可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin A的表達(dá)調(diào)控肝癌細(xì)胞周期，從而抑制其增殖。

PI3K-Akt 信號在HCC 細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期調(diào)控過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Zhang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，長非編碼RNA uc.338 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，可能通過PI3K-Akt 通路靶向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞p21下調(diào)和Cyclin D1 上調(diào)。Ye 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人肝細(xì)胞癌中βKlotho 表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)βKlotho 明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時表達(dá)βKlotho 明顯降低Akt 和GSK-3β 的磷酸化水平并誘導(dǎo)下調(diào)cyclin D。以上研究均提示PI3K-Akt 信號在調(diào)控cyclin D1 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，新甘草酚能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞PI3K-Akt 信號通路的活化，并且抑制cyclin D1 的表達(dá)（P＜0.05）。Akt 抑制劑實驗顯示，Akt 抑制劑能夠明顯降低cyclin D1 的表達(dá)（P＜0.05），認(rèn)為新甘草酚可能通過PI3K-Akt正向調(diào)控cyclin D1 表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)甘草單體成分新甘草酚能有效抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 的增殖，其作用機制可能與PI3K-Akt 信號活化、細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin A 調(diào)控的細(xì)胞周期相關(guān)。