張秀軍 么春艷 陶曉東 孫金軍

急性肺損傷（ALI）是危及生命的呼吸衰竭疾病，由原發(fā)性肺炎、胸膜膿毒癥、吸入性肺炎等引起[1]。盡管ALI 的治療策略已取得較大進(jìn)步，但ALI 在敗血癥相關(guān)的重癥患者中仍有較高的死亡率[2-3]。研究表明，LPS 誘導(dǎo)小鼠ALI 模型中，活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生抑制核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/醌氧化還原酶（NQO1）抗氧化信號(hào)，促進(jìn)炎癥因子分泌，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[4]。近年來，微小RNA（miRNAs）已被建議作為ALI 的診斷生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 破壞ROS 的產(chǎn)生（下游介體），并參與ROS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。然而miRNA 能否通過調(diào)控ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與ALI 進(jìn)程尚不明確。miR-28-5p 位于染色體3q28 上，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中表達(dá)上調(diào)，起到促進(jìn)腫瘤的作用[7-8]，并參與炎癥以及氧化還原反應(yīng)[9]?；诖?，本研究將明確miR-28-5p 在ALI 中的功能和作用機(jī)制，為ALI 靶向治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 C57BL/6 小鼠（SPF 級(jí)），雄性，7～8 周齡，22～25g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障中，明暗各12h，給予充足食物和無菌水。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（審批號(hào)：20190170）。

1.2 細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（目錄號(hào)SCSP-538）。培養(yǎng)條件：含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，加1%PSG 雙抗。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)傳代至20%。

1.3 試 劑 RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)025646）、胎牛血清（批號(hào)5737）購自美國CORNING 公司；脂多糖（LPS）（批號(hào)46683）購自美國Sigma 公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號(hào)2385）、白介素-1β（IL-1β）（批號(hào)18844456）等炎癥因子檢測(cè)試劑盒購自上海翊盛生物科技有限公司。Nrf2 兔單抗（批號(hào)795564）、血紅素加氧酶（HO-1） 兔單抗（批號(hào)238964）、NQO1 兔單抗（批號(hào)454529）均購自美國CST 公司。GAPDH 作為內(nèi)參。

1.4 儀 器 iD5 多功能微孔板讀板機(jī)（酶標(biāo)儀），美谷分子儀器（上海） 有限公司；1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages 生物安全柜，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Odyssey TMLi-COR 檢測(cè)系統(tǒng)，上?；蛴邢薰?；Thermo fisher -80℃超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠ALI 模型構(gòu)建 將40 只SPF 級(jí)C57BL/6雄鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，分別為生理鹽水組、ALI-3h 組、ALI-6h 組、ALI-12h 組，每組10 只。造模組通過氣道滴入LPS 1.5mg/kg，誘導(dǎo)3h（ALI-3h組）、6h（ALI-6h 組）、12h（ALI-12h 組）后分批處死小鼠，生理鹽水組氣道滴注等體積生理鹽水。利用生理鹽水灌洗抽取支氣管肺泡灌洗液，取一葉肺組織用于提取RNA。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子含量測(cè)定 將分離出來的小鼠肺泡灌洗液，300rpm，4℃離心10min后，去上清，利用ELISA 試劑盒，按說明書要求，測(cè)定上清中TNF-α、IL-1β 含量。

2.3 小鼠肺巨噬細(xì)胞株RAW264.7 培養(yǎng)與處理 培養(yǎng)條件：CORNING RPMI 1640 培養(yǎng)基+10% FBS。培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80%時(shí)傳代培養(yǎng)。將RAW264.7鋪板于24 孔板，利用10mM 的LPS 分別刺激3、6、12h 后收集細(xì)胞上清液，同樣采用ELISA 試劑盒，按說明書要求，測(cè)定上清液TNF-α、IL-1β 的含量。收集蛋白利用RIPA 中裂解液裂解蛋白，經(jīng)離心后測(cè)定蛋白濃度，加入loading 100℃煮8min，上樣檢測(cè)Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)水平。提取RNA 利用TRIzol 法裂解，經(jīng)逆轉(zhuǎn)為cDNA 后進(jìn)行熒光定量PCR（RT-PCR）。

2.4 設(shè)計(jì)miR-28-5p mimic，轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞 miR-28-5p mimic 和對(duì)應(yīng)的mimic-NC 購自QIAGEN，利用QIAGEN 提供HiPerFect Transfection Reagent 進(jìn)行miRNA Mimic 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h 后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)miR-28-5p、TNF-α、IL-1β、Nrf2、HO-1、NQO1 表達(dá)水平 對(duì)于肺組織樣，將組織剪碎后加入TRIzol 進(jìn)行勻漿。對(duì)于細(xì)胞，直接加入TRIzol裂解細(xì)胞，并利用三氯甲烷-異丙醇-乙醇進(jìn)行分離提取，逆轉(zhuǎn)為cDNA 后進(jìn)行熒光定量PCR。PCR 引物如下：miR-28-5p：5'-AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG-3'；TNF-α（Forward：5'-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3'，Reverse：5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3'）；IL-1β（Forward：5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'，Reverse：5'-CTGGATGCTCTCATCAGGACA-3'）；Nrf2（Forward：5'-GGCGTTAGAAAGCATCCTTCC-3'，Reverse：5'-GCAGAGGGCACACTCAAAGT-3'）；HO-1（Forward：5'-ATGACACCAAGGACCAGAGC-3'，Reverse：5'-GTGTAAGGACCCATCGGAGA-3'）；NQO1（Forward：5'-TCACCACCTACTTTGCTCCAA-3'，Reverse：5'-TTTTTCGCTCCTCTTGAACCT-3'）。上述引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

2.6 Western bolt 檢測(cè)Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白水平 提取ALI 小鼠肺組織蛋白時(shí)，將組織剪碎后加入RIPA 強(qiáng)裂解液裂解，經(jīng)過離心后測(cè)定上清液蛋白濃度。提取細(xì)胞蛋白時(shí)，將細(xì)胞上清吸取后加入PBS 洗一遍，加入RIPA 中裂解液裂解蛋白，離心測(cè)定蛋白濃度。收集好蛋白樣后進(jìn)行凝膠電泳，過夜孵育一抗后，室溫孵育熒光二抗1h，利用熒光掃膜儀掃膜。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 miR-28-5p 在LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 模型肺組織表達(dá) 利用LPS 氣道滴入誘導(dǎo)ALI 病理模型后，分別在0、3、6、12h 收集小鼠支氣管肺泡灌洗液和肺組織。與生理鹽水組相比，LPS 刺激3、6、12h 后支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β 含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明ALI 模型構(gòu)建成功，且3h 時(shí)TNF-α、IL-1β 含量增加最明顯（P＜0.05）。隨后利用肺組織RNA 檢測(cè)miR-28-5p 表達(dá)，與生理鹽水組相比，LPS 刺激3、6、12h 后肺組織miR-28-5p表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在3h時(shí)miR-28-5p 表達(dá)升高最明顯（P＜0.05），與TNF-α、IL-1β 含量升高趨勢(shì)一致。見表1-2。

表1 LPS 造模不同時(shí)間點(diǎn)肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β相對(duì)含量（）

表1 LPS 造模不同時(shí)間點(diǎn)肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β相對(duì)含量（）

注：生理鹽水組為生理鹽水處理小鼠；ALI-3h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 3h；ALI-6h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 6h；ALI-12h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 12h；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細(xì)胞介素1β；ALI 為急性肺損傷；LPS 為脂多糖；與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與ALI-3h組比較，bP＜0.05

3.2 LPS 刺激巨噬細(xì)胞后miR-28-5p 表達(dá) 利用LPS 刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生M1 型極化。與生理鹽水組相比，LPS 刺激3、6、12h后細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β 含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明LPS 刺激后巨噬細(xì)胞發(fā)生了M1 型極化。同時(shí)檢測(cè)LPS 刺激巨噬細(xì)胞后miR-28-5p 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-28-5p 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與ALI-3h 組比較，ALI-6h 組和ALI-12h組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β 及胞內(nèi)miR-28-5p 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3-4。

表2 LPS 造模不同時(shí)間點(diǎn)肺組織miR-28-5p相對(duì)表達(dá)（）

表2 LPS 造模不同時(shí)間點(diǎn)肺組織miR-28-5p相對(duì)表達(dá)（）

注：生理鹽水組為生理鹽水處理小鼠；ALI-3h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 3h；ALI-6h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 6h；ALI-12h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 12h；miR-28-5p 為微小RNA28-5p；ALI 為急性肺損傷；LPS 為脂多糖；與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與ALI-3h 組比較，bP＜0.05

表3 LPS 處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β 相對(duì)含量（）

表3 LPS 處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β 相對(duì)含量（）

注：生理鹽水組為生理鹽水處理小鼠；ALI-3h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 3h；ALI-6h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 6h；ALI-12h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 12h；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細(xì)胞介素1β；ALI 為急性肺損傷；LPS 為脂多糖；與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與ALI-3h組比較，bP＜0.05

表4 LPS 處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)miR-28-5p相對(duì)表達(dá)（）

表4 LPS 處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)miR-28-5p相對(duì)表達(dá)（）

注：生理鹽水組為生理鹽水處理小鼠；ALI-3h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 3h；ALI-6h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 6h；ALI-12h 組為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)小鼠ALI 12h；miR-28-5p 為微小RNA28-5p；ALI 為急性肺損傷；LPS 為脂多糖；與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與ALI-3h 組比較，bP＜0.05

3.3 miR-28-5p mimic 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化設(shè)計(jì)miR-28-5p mimic 后轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果顯示miR-28-5p mimic 表達(dá)水平升高（P＜0.05）（見表5），提示miR-28-5p mimic 轉(zhuǎn)染成功。隨后檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與mimic-NC 組比較，miR-28-5p mimic 過表達(dá)明顯增強(qiáng)TNF-α 和IL-1β 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示巨噬細(xì)胞中miR-28-5p 可能發(fā)揮著促炎作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

表5 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

注：mimic-NC 組為轉(zhuǎn)染mimic-NC 對(duì)照巨噬細(xì)胞；miR-28-5p mimic為轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 巨噬細(xì)胞；miR-28-5p 為微小RNA28-5p；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細(xì)胞介素1β；與mimic-NC 組比較，aP＜0.05

3.4 miR-28-5p 促進(jìn)Nrf2 及其信號(hào)表達(dá) 與生理鹽水組比較，LPS 刺激巨噬細(xì)胞后Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 后，同樣Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示miR-28-5p 可能通過調(diào)控Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 的表達(dá)，介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的極化和炎癥因子的分泌（見表6-7）。Western bolt 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。見圖1。

表6 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

表6 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

注：生理鹽水組為生理鹽水處理細(xì)胞；LPS 組為L(zhǎng)PS 處理細(xì)胞3h；LPS為脂多糖；miR-28-5p 為微小RNA28-5p；Nrf2 為氧化關(guān)鍵分子核因子E2 相關(guān)因子2；HO-1 為血紅素加氧酶；NQO1 為醌氧化還原酶；與生理鹽水組比較，aP＜0.05

表7 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

表7 RT-PCR 檢測(cè)各組RNA 表達(dá)水平（）

注：mimic-NC 組為轉(zhuǎn)染mimic-NC 對(duì)照巨噬細(xì)胞；miR-28-5p mimic為轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 巨噬細(xì)胞；miR-28-5p 為微小RNA28-5p；Nrf2 為氧化關(guān)鍵分子核因子E2 相關(guān)因子2；HO-1 為血紅素加氧酶；NQO1 為醌氧化還原酶；與mimic-NC 組比較，aP＜0.05

3.5 miR-28-5p 靶向Nrf2 基因3'UTR 序列 為進(jìn)一步了解miR-28-5p 的靶基因，我們通過Targetscan 7.0 分析，得到miR-28-5p 靶向Nrf2 的3'UTR 序列（見表8）。后續(xù)通過突變Nrf2 3'UTR 中miR-28-5p結(jié)合位點(diǎn)，利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-28-5p 對(duì)Nrf2 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，結(jié)果顯示，與mimic-NC+Nrf2 WT 組比較，miR-28-5p mimic+Nrf2 WT組的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而同時(shí)共轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 和Nrf2 MUT 后，這種抑制效果得到了回復(fù)，見表9。

表8 Targetscan 預(yù)測(cè)miR-28-5p 靶向Nrf2 基因3'UTR 序列

圖1 miR-28-5p 對(duì)巨噬細(xì)胞Nrf2 信號(hào)的影響

表9 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-28-5p 對(duì)Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控（）

表9 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-28-5p 對(duì)Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控（）

注：mimic-NC+Nrf2 WT 組為巨噬細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mimic-NC 和Nrf2 WT；miR-28-5p mimic+Nrf2 WT 組為巨噬細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 和Nrf2 WT；mimic-NC+Nrf2 MUT 組為巨噬細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mimic-NC 和Nrf2 MUT；miR-28-5p mimic+Nrf2 MUT 組為巨噬細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 和Nrf2 MUT；ns 為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與mimic-NC+Nrf2 WT 組比較，aP＜0.05

4 討論

近年多項(xiàng)研究提示，miRNAs 可作為ALI 疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估更好的生物標(biāo)志物[10-11]。Liu 等[12]研究表明，miR-155 在急性炎癥性肺損傷中活躍表達(dá)。此外，若干miRs，包括miR-574，miR-486-5p 和miR-495 在ALI 中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13-15]。提示miRs在ALI 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，然而miR-28-5p 在ALI 中的作用尚未報(bào)道。為了探究miR-28-5p 在ALI 中的作用，利用LPS 構(gòu)建小鼠ALI 模型，體外利用LPS 刺激巨噬細(xì)胞M1 型極化，結(jié)果均顯示，miR-28-5p 在LPS 誘導(dǎo)的ALI 中表達(dá)升高，可能促進(jìn)ALI 過程炎癥的發(fā)生。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們?cè)诰奘杉?xì)胞中過表達(dá)miR-28-5p mimic，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-28-5p mimic 后，巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α 和IL-1β 水平明顯升高。

Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、異源生物代謝和排泄、炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞生物能的基因表達(dá)。大量研究表明，Nrf2 激活在針對(duì)ALI/ARDS 的保護(hù)中非常重要[16-17]。NQO1 是主要的Nrf2 下游靶基因之一，被認(rèn)為是主要抗氧化劑[18]。有趣的是NQO1 啟動(dòng)子區(qū)域參與ALI，NQO1 表達(dá)上調(diào)以響應(yīng)氧化應(yīng)激，NQO1 表達(dá)的增加可以預(yù)防高氧性肺損傷[19]。本研究通過Targetscan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-28-5p 直接靶向Nrf2 基因3'UTR 序列，進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果。我們?cè)诰奘杉?xì)胞中過表達(dá)miR-28-5p mimic 檢測(cè)Nrf2 的表達(dá)及其下游蛋白HO-1、NQO1 的表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-28-5p mimic 后，Nrf2 的表達(dá)及其下游蛋白HO-1、NQO1 的表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步證明了miR-28-5p 可能通過調(diào)控了Nrf2/HO-1/NQO1 信號(hào)參與調(diào)控ALI過程中巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上，本研究表明miR-28-5p 上調(diào)通過增加炎癥因子的分泌在ALI 疾病中起促進(jìn)作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-28-5p 負(fù)調(diào)控Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子。因此，miR-28-5p與Nrf2 信號(hào)通路結(jié)合可能有助于更好地了解ALI的預(yù)防機(jī)制，有望成為ALI 潛在的生物標(biāo)志物。