林 晴，王文義，潘丹虹，黃艷峰，付長龍，葉錦霞*

1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州350122；2 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122

* 通信作者：葉錦霞，E-mail：xiaoyezi1203@126.com

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種嚴重影響患者生活質量的慢性、退行性關節(jié)疾病。 隨著我國人口老齡化趨勢加重，該病發(fā)病率顯著增高，預計到2020 年將成為第4 大致殘性疾?。?］。其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是關節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質增生，主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、腫脹晨僵、活動不利、甚者關節(jié)畸形等［2-3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎的發(fā)病與內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導的軟骨細胞凋亡有著密切關系［4］。內質網(wǎng)是Ca2＋主要儲存場所，Ca2＋作為細胞凋亡信號之一，當細胞受到外源性化合物影響時，內質網(wǎng)內的Ca2＋穩(wěn)態(tài)破壞，代謝紊亂，繼而激發(fā)ERS 出現(xiàn)細胞凋亡［5］。 毒胡蘿卜素（Thapsigargin，TG）是Ca2＋-ATP 酶抑制劑，可使未折疊或異常折疊的蛋白在軟骨細胞內蓄積或使內質網(wǎng)內Ca2＋穩(wěn)定失衡，常被用來制作軟骨細胞ERS 模型［6］。前期臨床試驗及動物實驗研究表明，獨活寄生湯通過緩解關節(jié)軟骨退變對膝骨關節(jié)炎有良好療效［7-9］。目前對于骨關節(jié)炎的治療手段頗多，主要以減輕癥狀，延緩病程進展為主要目的，但仍缺乏特效療法［10］。本研究通過觀察獨活寄生湯在ERS 下對Ca2＋平衡及軟骨細胞凋亡的影響，以期探討其防治骨關節(jié)炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠20 只，雄性，4 周齡，體質量90～100 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0005。 本實驗的開展已獲得福建中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（批準文號：〔2019〕福中醫(yī)倫理審字第007 號）。

1.2 實驗藥物

獨活寄生湯購自福建省第三人民醫(yī)院，全方由獨活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃各6 g 組成。 采用70%乙醇回流提取的方法制備，合并濾液，濃縮、干燥。 將獨活寄生湯提取物用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配制成64 mg／mL 溶液，置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?使用前用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成所需濃度，并用0.22 μm 的無菌型微孔濾膜過濾。

1.3 主要實驗試劑和設備

見表1。

表1 主要試劑及設備Table 1 Main reagents and instruments

1.4 實驗方法

1.4.1 軟骨細胞體外培養(yǎng)體系的建立及鑒定 用1%戊巴比妥將2 只SD 大鼠麻醉后脫頸處死，用75%酒精浸泡5 min，用骨剪截取膝關節(jié)，用75%酒精浸泡10 min 后帶入超凈工作臺操作：先用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）充分漂洗，刮除關節(jié)周圍附著的組織如肌肉、骨膜、滑膜。 用手術刀片削取每個關節(jié)表面的軟骨，以不滲血為度。 PBS充分漂洗軟骨小塊3 次。 用手術刀片切碎至1 mm大小，PBS 沖洗2 次后，置入含8 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的玻璃瓶中，置于37 ℃，100 r／min 水浴搖床消化，每2 h 吸取1 次上清液，120 目尼龍網(wǎng)篩過濾，所得濾液1 000 r／min，離心5 min，棄上清液，收集細胞沉淀，重復3 次。 用含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle media，DMEM）重懸細胞，吹打混勻后接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱原代培養(yǎng)，48 h 后倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，以后2～3 d 更換培養(yǎng)液1 次，直到長成細胞單層，選第2 代軟骨細胞，0.25%胰蛋白酶消化備用。 第3 代軟骨細胞采用甲苯胺藍染色法鑒定并進行后續(xù)實驗。

1.4.2 CCK-8 法檢測軟骨細胞的存活率 第2 代軟骨細胞以1.0×105個／mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，24 h 后觀察細胞生長，至50%～60%時，將細胞分為空白組，模型組，獨活寄生湯低、中、高劑量組，每組設置5 個復孔。

1.4.2.1 空白組 孔中加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基100 μL。

1.4.2.2 模型組 孔中加入劑量為25 μmol／L TG（DMEM 完全培養(yǎng)基配制）100 μL 作用4 h［11］。

1.4.2.3 獨活寄生湯低、中、高劑量組 孔中加入劑量為25 μmol／L TG 的含血清培養(yǎng)基100 μL 作用4 h后，吸棄培養(yǎng)基換成100、200、400 μg／mL 不同濃度的獨活寄生湯（DMEM 完全培養(yǎng)基配制）。 作用24 h后，每孔直接加入CCK-8 溶液10 μL，37 ℃、5%CO2，孵育4 h，終止培養(yǎng)，在450 nm 波長的酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值［12-13］。

1.4.3 Hoechst 33342 檢測軟骨細胞凋亡情況 各組干預后，棄除培養(yǎng)基，用PBS 洗1 次，加入4%多聚甲醛，固定15 min。 棄除固定液，用PBS 洗3 次，每次搖晃3 min，加入10 μg／mL Hoechst 33342 染色液1 mL，染色30 min，期間搖晃幾次使其染色充分均勻，去染色液，用PBS 洗3 次，每次搖晃3 min，最后加入200 μL PBS，用共聚焦顯微鏡觀察軟骨細胞的凋亡情況。

1.4.4 雙轉盤激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內Ca2＋濃度實時動態(tài)變化 采用Ca2＋敏感熒光探針Fluo-3／AM 進行細胞內Ca2＋熒光標記，配制終濃度為50 μmol／L Fluo-3／AM 和10 μg／mL Hoechst 33342混合液（DMEM 培養(yǎng)基配制），加于培養(yǎng)的軟骨細胞樣品上，置于5% CO2孵箱中孵育30 min。PBS 液漂洗1 次，雙轉盤激光共聚焦顯微鏡進行觀察，選擇適當?shù)膮?shù)對細胞進行動態(tài)掃描（Fluo-3／AM：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm；Hoechst 33342：激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm），每組選取5 個細胞，采用系統(tǒng)自帶軟件，根據(jù)熒光強度變化-時間的曲線圖，得出反映細胞內游離Ca2＋濃度動態(tài)變化的曲線。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布使用單因素方差分析，若方差齊則使用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用Gams-Howell 檢驗；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 軟骨細胞的形態(tài)結構及鑒定

2.1.1 甲苯胺藍染色鑒定 接種后，細胞呈圓形，漂浮于培養(yǎng)液中，24 h 后，大多數(shù)軟骨細胞開始貼壁，伸展并形成偽足樣突起。 培養(yǎng)第7 天，軟骨細胞增殖逐漸融合成單層，呈不規(guī)則“鋪路石”樣。 第2 代、第3 代軟骨細胞形態(tài)規(guī)則、大小一致，邊界清晰。 第4 代開始軟骨細胞逐漸呈長梭形，分化為成纖維細胞。 選取第3 代軟骨細胞進行甲苯胺藍染色，可見細胞內藍紫色異染顆粒，細胞周圍可見異染顆粒。見圖1。

圖1 甲苯胺藍染色鑒定（×200）Figure 1 Identification using toluidine blue staining (×200)

2.1.2 軟骨細胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察各

組軟骨細胞的形態(tài)，空白組呈單層鋪路石狀生長；

模型組和獨活寄生湯各劑量組細胞形態(tài)由鋪路石

狀呈現(xiàn)多角形增加，偽足變長，細胞呈皺縮狀態(tài)、細胞間隙變大、數(shù)量變少，懸浮死細胞增多。 獨活寄生湯各劑量組與模型組比較，細胞數(shù)量明顯增多，細胞胞質均勻。 見圖2。

圖2 第3 代軟骨細胞形態(tài)（×100）Figure 2 Morphological observation of the third chondrocytes （×100）

2.2 CCK-8 法檢測獨活寄生湯對軟骨細胞存活率的影響

與空白組相比，模型組的存活率較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而獨活寄生湯各劑量組的存活率均比模型組高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其對軟骨細胞的保護作用隨劑量的升高而增高，具有一定的量效關系（P＜0.05）。 見表2。

2.3 Hoechst 33342 檢測軟骨細胞凋亡情況

共聚焦顯微鏡下觀察，空白組細胞核出現(xiàn)彌散均勻的低密度亮藍色熒光，凋亡細胞較少。 模型組的凋亡細胞數(shù)量顯著增多，其細胞核固縮、呈顆粒狀熒光，部分呈半月形增加。 獨活寄生湯各劑量組的細胞凋亡數(shù)比模型組明顯減少，只有少量凋亡細胞呈高密度的亮藍色或半月形，且獨活寄生湯各組的細胞凋亡數(shù)量伴隨劑量增高而減少，呈現(xiàn)一定量效關系（P＜0.05）。 見圖3、圖4。

表2 5 組軟骨細胞活性比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of chondrocytes in five groups （±s）

表2 5 組軟骨細胞活性比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of chondrocytes in five groups （±s）

注：與模型組比較，1） P＜0.05。Note: Compared with the model group, 1) P＜0.05.

細胞活性（吸光值）3.68±0.051）1.91±0.13 2.50±0.061）2.64±0.081）2.76±0.101）組別空白組模型組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組n 5 5 5 5 5劑量／（μmol／L）—25 100 200 400

圖3 Hoechst 33342 檢測軟骨細胞凋亡情況（×400）Figure 3 Detection of chondrocyte apoptosis by Hoechst 33342 staining (×400)

圖4 5 組軟骨細胞凋亡率Figure 4 The apoptosis rate of chondrocytes in five groups

圖5 雙轉盤激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內Ca2+熒光強度（×400）Figure 5 Observation of Ca2+ fluorescence intensity in cells by double rotary laser confocal microscope (×400)

2.4 雙轉盤激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內Ca2+濃度實時動態(tài)變化

空白組Ca2＋熒光強度較弱且均一，觀察30 min后，仍處于穩(wěn)定的狀態(tài)。 與空白組比較，模型組中Ca2＋釋放明顯增多，熒光強度顯著增強，熒光波譜顯示Ca2＋火花較頻繁，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，獨活寄生湯中、高劑量組（200、400 μg／mL）軟骨細胞Ca2＋火花明顯減少，且能較快恢復到Ca2＋穩(wěn)態(tài)，獨活寄生湯低劑量組（100 μg／mL）雖然仍有部分Ca2＋火花，但熒光強度明顯比模型組弱，熒光強度-時間的動態(tài)變化曲線趨于平緩。 見圖5、圖6。

圖6 5 組Ca2+濃度動態(tài)變化Figure 6 Dynamic changes of Ca2+concentration in five groups

3 討 論

3.1 TG 可建立穩(wěn)定的軟骨細胞ERS 模型

本研究采用機械-0.2%Ⅱ型膠原酶消化法獲取大量軟骨細胞， 甲苯胺藍染色可見細胞內藍紫色異染顆粒， 證實本研究建立了穩(wěn)定的軟骨細胞體外培養(yǎng)體系［11］。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在OA 患者的軟骨細胞中存在ERS， 且內質網(wǎng)過載會誘導軟骨細胞的凋亡，導致軟骨細胞外基質合成和降解代謝失衡，從而加速OA 的病理進程［12］。

本實驗運用Ca2＋-ATP 酶抑制劑TG 建立軟骨細胞ERS 模型［13］。ERS 可通過激活未折疊蛋白反應觸發(fā)細胞凋亡［14－15］。 實驗結果表明，25 μmol／L TG作用于軟骨細胞4 h，顯微鏡下可觀察到軟骨細胞變形、間隙變大、數(shù)量變少，CCK－8 檢測結果顯示軟骨細胞存活率顯著降低，Hoechst 33342 染色可見明顯的細胞核固縮、碎裂，或呈月牙狀等細胞凋亡現(xiàn)象，故25 μmol／L TG 干預第3 代軟骨細胞4 h 即可建立合適而穩(wěn)定的軟骨細胞ERS 模型。 TAKADA 等［16］研究結果亦證實了ERS 相關蛋白與OA 軟骨細胞變性及凋亡均呈正相關。

3.2 獨活寄生湯可維持軟骨細胞內Ca2＋平衡

過度的ERS 會刺激Ca2＋通道活化，Ca2＋作為凋亡過程中重要的信號，可通過調節(jié)Ca2＋敏感的關鍵酶誘導細胞凋亡［17-19］。研究表明，獨活寄生湯含藥血清可抑制因ERS 反應引起的軟骨細胞凋亡［20］，但尚未深入探索其是否通過維持細胞內Ca2＋平衡而發(fā)揮作用。 本研究采用雙轉盤激光共聚焦顯微鏡實時觀察發(fā)現(xiàn)，模型組細胞內Ca2＋釋放增多、火花出現(xiàn)頻繁、熒光強度顯著增強，與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義，可見在TG 誘導的軟骨細胞ERS 模型中存在Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡現(xiàn)象。 謝文斌［21］在進行人膝關節(jié)OA 原位軟骨細胞自發(fā)性Ca2＋信號特征分析時亦證實了人膝關節(jié)原位軟骨深層細胞自發(fā)性Ca2＋信號與軟骨退變程度呈負相關。 當加入獨活寄生湯中、高劑量進行干預時，細胞內Ca2＋火花釋放減少，熒光強度減弱，熒光強度-時間的動態(tài)變化曲線趨于平緩，能很快地恢復到鈣平衡狀態(tài)。Hoechst 33342染色可見獨活寄生湯干預時軟骨細胞凋亡數(shù)量減少，CCK－8 檢測亦提示獨活寄生湯組細胞存活率較模型組高。 這提示，獨活寄生湯可維持軟骨細胞內鈣平衡，減輕ERS 反應和軟骨細胞凋亡。

4 小 結

在OA 的病理過程中，Ca2＋介導的軟骨細胞凋亡在骨性關節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。 由于關節(jié)軟骨中Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡，ERS 持續(xù)激活，進而引起軟骨細胞凋亡，導致軟骨合成和降解代謝失衡，最終造成軟骨細胞外基質和關節(jié)軟骨破壞。 本研究證實，獨活寄生湯可通過維持關節(jié)軟骨內鈣平衡，減輕ERS，減少軟骨細胞凋亡，從而對關節(jié)軟骨產生保護作用，但是目前獨活寄生湯如何通過調控相關蛋白表達以及信號通路維持鈣穩(wěn)態(tài)尚未完全闡明，未來可基于以上研究進一步深入探討獨活寄生湯的作用機制，為OA 的早期預防及治療提供新思路。