高 娜

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 定西校區(qū)藥學(xué)教學(xué)部，甘肅 定西 743000)

0 引言

開花的發(fā)生決定了高等植物具備繁殖和遺傳的能力，對(duì)植物個(gè)體和子代的發(fā)育具有重要的意義.作為高等植物的模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬于十字花科蕓薹屬，目前已發(fā)現(xiàn)擬南芥中開花相關(guān)基因位點(diǎn)有80個(gè)，其中有20個(gè)是和晚花相關(guān)[1-3].通過對(duì)這些基因功能的研究，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控開花的一些遺傳途徑和相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，加快了對(duì)于擬南芥甚至于高等植物花期發(fā)生和轉(zhuǎn)變的研究步伐[4-6].本實(shí)驗(yàn)針對(duì)擬南芥lf突變體生長(zhǎng)周期緩慢，花期推遲的生理現(xiàn)象，通過3周的春化處理觀察其花期變化，并采用Q-PCR技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄水平上分析了LF基因和開花抑制基因FLC的關(guān)系，初步分析并確定LF作為正調(diào)控基因通過抑制FLC偶聯(lián)春化途徑參與了擬南芥開花的調(diào)控.

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)中使用的晚花突變體材料lf及LF基因超表達(dá)材料35S：：LF均來自蘭州大學(xué)生命科學(xué)院.本實(shí)驗(yàn)中使用的擬南芥野生型Col、晚花突變體材料lf及LF基因超表達(dá)材料35S：：LF均來自蘭州大學(xué)生命科學(xué)院.

選擇飽滿的種子懸浮在0.1%的瓊脂液中，于4 ℃冷處理72 h，之后將其播種至土壤中.根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇不同的光周期條件，包括長(zhǎng)日照(16 h光照/8 h黑暗)和短日照條件(8 h光照/16 h黑暗)，溫度保持在22 ℃左右，相對(duì)濕度為70%～90%.

1.2 方法

1.2.1 開花時(shí)間的統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分別統(tǒng)計(jì)了長(zhǎng)日照和短日照培養(yǎng)條件下野生型Col，lf和35S：：LF在花莖1 cm時(shí)的蓮座葉數(shù)目和相應(yīng)的開花天數(shù)，并據(jù)此計(jì)算出相應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差.

1.2.2 春化處理

種子種植在MS平板上，4 ℃暗處理3周后移栽至土壤中，并在長(zhǎng)日照條件下統(tǒng)計(jì)開花數(shù)據(jù).

1.2.3 熒光定量PCR(Q-PCR)分析相關(guān)基因的表達(dá)量

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

開花基因FLC表達(dá)量分析：長(zhǎng)日照選擇生長(zhǎng)14 d的幼苗，在控時(shí)因子為16 h時(shí)提取葉片部位的RNA；短日照則選擇生長(zhǎng)17 d的幼苗，在控時(shí)因子為8 h時(shí)提取葉片部位的RNA，后續(xù)處理一致.

春化處理后基因表達(dá)量分析(FLC)：選擇突變體和野生型均出現(xiàn)4～5片蓮座葉時(shí)，提取幼苗的RNA.

1.2.3.2 熒光定量PCR(Q-PCR)

本實(shí)驗(yàn)選用E.Z.N.ATM植物RNA提取試劑盒來提取總RNA，cDNA第一鏈合成時(shí)的試劑盒為TaKaRa公司提供的PrimeScriptTMRT-PCR Kit，RNA提取及cDNA第一鏈合成條件參見文獻(xiàn)[7].使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ來做定量PCR實(shí)驗(yàn)，所用的引物序列為：FLC-F：GACTAGAGCCAAGAAGACCG；FLC-R：GAAGATTGTCGGAGATTTGT(Sequences(5′→3′)).

2 結(jié)果

2.1 不同光周期lf突變體花期變化分析

在長(zhǎng)日照和短日照條件下，分別觀察野生型Col、超表達(dá)材料35S：：LF及缺失突變體lf的花期，并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的開花數(shù)據(jù).圖1結(jié)果顯示：不同光周期的lf突變體花期都遲于野生型.長(zhǎng)日照推遲17 d，抽薹時(shí)蓮座葉數(shù)目比野生型多了7片(圖1-A和1- B)；短日照推遲40 d，蓮座葉多了12片(圖1-C和1-D).35S：：LF比野生型更早抽薹，長(zhǎng)日照提前6 d，蓮座葉減少了3片(圖1-A和1-B)；短日照提前了20 d，蓮座葉也少了10片(圖1-C和1-D).

2.2 lf突變體中開花整合因子FLC轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

為更進(jìn)一步分析LF在開花調(diào)控中的作用，運(yùn)用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)了擬南芥關(guān)鍵控花因子FLC的表達(dá)量.圖2結(jié)果顯示：開花抑制因子FLC在不同光周期的lf突變體中都有很高的表達(dá)量，長(zhǎng)日照高于野生型2倍，短日照甚至達(dá)到4.4倍，其表達(dá)量升高完全對(duì)應(yīng)于lf晚花表型；提前開花的超表達(dá)材料中FLC的表達(dá)量低于野生型，長(zhǎng)日照降低了32%，短日照則降低了65%(圖2-A和2-B).

2.3 lf突變體春化處理后花期及FLC轉(zhuǎn)錄水平分析

lf晚花突變體中FLC的表達(dá)水平較高，表明該突變體可能對(duì)于春化作用敏感.

圖3的結(jié)果表明：3周的春化處理后發(fā)現(xiàn)：Col蓮座葉數(shù)目?jī)H減少2片，花期沒有明顯提前，內(nèi)源的FLC表達(dá)量也基本上沒有變化.已報(bào)道Col和其他擬南芥生態(tài)型不同，其對(duì)于春化效應(yīng)不敏感，且內(nèi)源的FLC水平極低[6]；lf蓮座葉數(shù)目減少了8片，花期明顯提前(圖3-C)，且FLC處理后明顯下調(diào)，降幅為40%，表明LF通過FLC調(diào)控的春化途徑參與了擬南芥開花(圖3-D).

3 討論

高等植物的開花過程是分別響應(yīng)于環(huán)境因素和內(nèi)在調(diào)控因子的，是一個(gè)復(fù)雜且精密的生物反應(yīng)過程[8].目前已經(jīng)確定在擬南芥中存在6條開花遺傳途徑，即光周期途徑、赤霉素途徑、春化途徑、溫度途徑、年齡途徑和自主途徑[9-12].在各條遺傳途徑相互作用的過程中，存在一些關(guān)鍵的整合因子，如FLC、SOC1、FT以及下游的LFY，它們使得各條途徑相互交叉發(fā)揮協(xié)同作用，共同控制開花[13-14].FLC整合了自主途徑和春化途徑，作為一個(gè)關(guān)鍵的開花抑制因子，其表達(dá)量與對(duì)開花的抑制程度呈正相關(guān)[15-17].在本實(shí)驗(yàn)中，lf突變體晚花的現(xiàn)象與其內(nèi)源FLC轉(zhuǎn)錄水平的變化是一致的，顯示其缺失突變體晚花極有可能因?yàn)镕LC高水平的表達(dá)所致，而LF基因是作為正調(diào)控因子可抑制FLC的表達(dá)從而調(diào)控?cái)M南芥開花.

春化作為一個(gè)很重要的環(huán)境因素，可以很大程度上促進(jìn)擬南芥的開花[18].需春化的擬南芥生態(tài)型及突變體，它們對(duì)于春化的需求是因?yàn)閮?nèi)部高的FLC表達(dá)水平所致[19]，已報(bào)道的響應(yīng)于春化效應(yīng)的生態(tài)型C24，植株略晚花，但其內(nèi)源的FLC的表達(dá)水平卻很高，亦可以被低溫處理提前花期[20].本實(shí)驗(yàn)中春化處理lf突變體中FLC的表達(dá)水平下降了40%，在一定程度上逆轉(zhuǎn)晚花表型，亦表明LF通過FLC調(diào)控的春化途徑參與擬南芥開花.因此，根據(jù)突變體晚花表型和FLC基因的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果，初步推測(cè)出LF調(diào)控開花的方式可能是通過抑制FLC的轉(zhuǎn)錄水平且偶聯(lián)了春化途徑，作為一個(gè)正向因子參與擬南芥花期調(diào)控.