段 爭，次如冰，劉小強(qiáng)，王建國

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 呼吸二科， 河北 石家莊 050000； 2.河北省環(huán)境監(jiān)測中心站， 河北 石家莊 050051；3.石家莊市環(huán)境監(jiān)測中心， 河北 石家莊 050021)

空氣PM2.5暴露對肺炎克雷伯菌致大鼠肺部炎性反應(yīng)的影響

段 爭1*，次如冰1，劉小強(qiáng)2，王建國3

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 呼吸二科， 河北 石家莊 050000； 2.河北省環(huán)境監(jiān)測中心站， 河北 石家莊 050051；3.石家莊市環(huán)境監(jiān)測中心， 河北 石家莊 050021)

細(xì)顆粒物(particulate matter, PM 2.5)指空氣中空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，可沉積于各級支氣管、肺泡。研究證實PM2.5暴露可導(dǎo)致肺炎患者住院率增加，病死率增加，具體機(jī)制不明。

1 材料與方法

1.1 材料：清潔級6～8周齡雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量200～220 g(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：1302094)；肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)，稀釋為1.0×106個菌落形成單位(colony forming units,cfu) /mL混懸液待用； PM2.5由石家莊市環(huán)境監(jiān)測中心站提供，配制成30 mg/mL 懸液備用；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒(河北渤海生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備：100只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成4組。對照組：(20只)：氣管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉注射液(1 mL/kg)，24 h后重復(fù)；肺炎克雷伯菌感染組(Kb組,24只)：氣管內(nèi)滴入標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液(1.0×106cfu/mL/kg)，24 h后滴入0.9%氯化鈉注射液；PM2.5組(PM組,24只)：氣管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉注射液，24 h后滴入PM2.5懸液每千克30 mg/mL；肺炎克雷伯菌感染+PM2.5組(Kb+PM組,32只)：氣管內(nèi)滴入標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液，24 h后滴入PM2.5懸液；于1和7 d各處死部分動物。

1.2.2 觀察動物一般狀態(tài)并評分，統(tǒng)計各組7 d總死亡數(shù)。

1.2.3 血清中IL-6和 TNF-α測定：酶聯(lián)免疫吸附法測定。

1.2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計數(shù)。

1.2.5 大鼠肺組織病理觀察炎性反應(yīng)分級，氣管黏膜掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床評分及7 d時動物總死亡數(shù)比較： 1和7 d時各實驗組臨床評分顯著高于對照組, 1 d時Kb+PM組評分顯著高于PM組，7 d時Kb+PM組評分顯著高于Kb組、PM組(P<0.05)。Kb+PM組7 d時動物總死亡數(shù)為17只，顯著高于對照組、Kb組、PM組(P<0.05)。

2.2 BALF中菌落計數(shù)比較：7 d時Kb+PM組菌落計數(shù)顯著高于Kb組(表1)。

表1 BALF中肺炎克雷伯菌菌落計數(shù)比較

*P<0.05 compared with Kb group.

2.3 BALF中細(xì)胞計數(shù)及分類比較：1和7 d時Kb+PM組白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例顯著高于PM組和Kb組(表2)。

2.4 肺組織病理觀察及炎性反應(yīng)分級比較：Kb+PM組和Kb組支氣管周圍肺泡壁增厚、充血、破壞,中性粒細(xì)胞浸潤; PM組肺泡間隔增厚、纖維增生、炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔縮小(圖1)。肺臟炎性反應(yīng)分級示Kb+PM組炎性反應(yīng)分級明顯重于其余3組(P<0.05)。

2.5 氣管黏膜光鏡及電鏡觀察： 對照組大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞纖毛排列密集規(guī)整。PM組可見纖毛稀疏、黏連，部分倒伏脫落(圖1)。

A～D.pulmonary histopathology in different groups(HE，×100); A.control group; B.PM group; C.Kb group; D.Kb+PM group; E～F.tracheal membrane of rats(HE，×400); E.control group; F.PM group; G～H.tracheal membrane of rats observed by scanning electron microscope(×2000); G.control group; H.PM group

圖1 各組大鼠肺臟及氣管黏膜病理改變Fig 1 The changes of pulmonary histopathology and tracheal membrane histopathology in different groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with PM group;▲P<0.05 compared with Kb group;#P<0.05 compared with first day.

2.6 血清中IL-6和TNF-α含量比較： Kb+PM組7 d時IL-6含量及1和7 d時TNF-α含量顯著高于PM組和Kb組(表2)。

3 討論

本研究證實Kb+PM組肺臟炎性反應(yīng)分級、菌落計數(shù)及總病死率明顯高于Kb組，表明PM2.5暴露減低大鼠對肺炎克雷伯菌的清除，導(dǎo)致肺臟炎性反應(yīng)加重，病死率增加。有研究證實，顆粒物暴露減弱吞噬細(xì)胞對細(xì)菌吞噬功能，使細(xì)菌計數(shù)增加[1]，細(xì)菌清除減低，與本研究結(jié)果一致。

PM2.5暴露加重大鼠肺部炎性反應(yīng)的機(jī)制不明，本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露后大鼠氣道上皮細(xì)胞纖毛變短、倒伏、脫落，提示PM2.5暴露可破壞呼吸道黏液纖毛屏障，導(dǎo)致分泌物及異物清除障礙,氣道免疫功能減弱[2]。此外，PM2.5暴露及細(xì)菌感染均引起炎性因子升高，與炎性因子升高相伴隨的是肺臟炎性反應(yīng)加重[3]，表明PM2.5暴露可通過增加炎性因子的產(chǎn)生，與細(xì)菌感染共同加重肺臟炎性反應(yīng)。一方面，炎性因子的增加可導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量減輕、精神萎靡等，加重肺部炎性反應(yīng)。另一方面，PM2.5暴露導(dǎo)致的細(xì)菌清除減少，肺內(nèi)細(xì)菌持續(xù)存在，炎性因子進(jìn)一步升高。

綜上所述，PM2.5暴露可以降低大鼠肺臟對肺炎克雷伯菌的清除率，加重肺臟炎性反應(yīng)，增加病死率，其機(jī)制可能與氣道黏液纖毛系統(tǒng)破壞及炎性因子相互作用有關(guān)。

[1] Sigaud S, Goldsmith CA, Zhou H,etal. Air pollution particles diminish bacterial clearance in the primedlungs of mice[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2007, 223:1- 9.

[2] Leopold PL, O’Mahony MJ, Lian XJ,etal. Smoking is associated with shortened airway cilia[J]. PLoS One, 2009,4:e8157.

[3] Phipps JC, Aronoff DM, Curtis JL,etal.Cigarette Smoke exposure impairs pulmonary bacterial clearance and alveolar macrophage complement-mediated phagocytosis of streptococcus pneumoniae[J]. Infect Immun, 2010, 78:1214- 1220.

2013- 10- 08

2013- 12- 23

*通信作者(correspondingauthor)：duanzheng1971@126.com

1001-6325(2014)08-1110-03

R 122.2

A