黃元霞 彭傳海 丁寧 邱忠平 李星 鄒美慧

（1. 西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031；2. 中鐵二局中心醫(yī)院，成都 610081）

膽固醇廣泛存在于人及動物體內，是體內組織細胞的基本活性物質。而機體內膽固醇過多可能會導致動脈脂質沉積，引發(fā)高脂血癥，從而提高心腦血管類疾病的發(fā)病率。因此，降低血清膽固醇對于防治高脂血癥、降低心腦血管疾病的發(fā)病率具有重要的意義［1］?？墒秤萌樗峋↙actic acid bacteria，LAB）是目前公認安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等級的食品微 生物［2］，可利用菌體本身以及在腸道中分泌膽鹽水解酶（Bile salt hyelrolase，BSH）來降低血清膽固醇，從而起到防治高脂血癥的作用［2-3］。BSH可將體內的復合膽鹽水解為游離膽鹽，促進游離膽鹽與膽固醇生成沉淀，沉淀不易被腸道吸收，會隨糞便排出體外，從而降低膽固醇含量［4］。乳酸菌在生長過程中會產出一種天然存在的功能性、非蛋白質氨基酸——γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），具有降血脂、降血壓等功能，可輔助治療心腦血管疾?。?］。此外，乳酸菌具有一定的抗氧化活性，可清除體內的自由基，進而改善氧化應激，平衡脂類代謝，減少高脂血癥的發(fā)生［6-7］。因此，乳酸菌作為一種功能性的保健食品，具有重要的開發(fā)潛力。

目前乳酸菌常常是降膽固醇和抗氧化的重要益生菌，但是多以單菌株的研究為主［8］，而對于乳酸菌制劑的降膽固醇以及抗氧化研究鮮見報道。干酪乳桿菌和哈伯氏乳桿菌具有抗氧化、降膽固醇、增強人體免疫等較多益生性能，且其效果較強，是目前市面上活菌飲料和乳制品中較常用的乳酸菌［9-10］；屎腸球菌是目前抗逆性較強的乳酸菌之一，其易在體內定植，且仍具有較多的益生性能［11］；同時干酪乳桿菌、哈伯氏乳桿菌和屎腸球菌在發(fā)酵過程中均可產有機酸等代謝產物，使得發(fā)酵液的pH降低，為乳酸菌提供合適的生長條件，抑制其它有害微生物的生長，這對于延長乳酸菌制劑的保存時間具有重要的意義［10-11］。

基于上述3種乳酸菌的益生性能，本研究從西南交通大學資源微生物技術研究中心實驗室篩選保藏的若干株乳酸菌中，通過研究各菌株的益生性能，獲得有較優(yōu)降膽固醇能力和抗氧化活性的干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6，制備為三聯(lián)乳酸菌，考察其對胃腸道環(huán)境的適應性、降膽固醇能力、GABA的含量以及抗氧化活性，以期為后續(xù)研究和開發(fā)功能性微生態(tài)制劑或保健食品提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6均篩選自市售酸奶、乳酸菌飲料，由西南交通大學資源微生物技術研究中心保藏2年，且能穩(wěn)定傳代5代以上，各菌的16S rDNA在GenBank的登陸號分別為MN809276、MN809277和MN809279。金雙歧三聯(lián)活菌制劑（內蒙古雙歧藥業(yè)有限公司）。

培養(yǎng)基以及人工胃腸液制備［12］：MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的培養(yǎng)與計數(shù)。高膽固醇培養(yǎng)基（0.1 mg/mL）用于乳酸菌降膽固醇能力檢測。人工胃液：NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%，HCl調pH為 2.5，過濾除菌備用。人工腸液：胰蛋白酶 0.10%，膽鹽0.30%，調pH至8.0，過濾除菌備用。

1.2 方法

1.2.1 三聯(lián)乳酸菌的制備 將冷凍干燥保存的供試菌株，使用前接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化菌株。利用牛津杯法對3株菌株進行拮抗實驗［13］。調節(jié)菌懸液活菌數(shù)，使得干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6的菌懸液的活菌數(shù)為2.0×109CFU/mL。然后按1∶1∶1混合得到三聯(lián)乳酸菌。將市售金雙歧活菌制劑作為對照組，按上述方法將其菌懸液活菌數(shù)調至相同。

1.2.2 人工胃腸液耐受性 將其接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，將1 mL發(fā)酵液與9 mL人工胃液混勻置37℃搖床中。然后移取1 mL處理2 h的含菌人工胃液與9 mL pH 6.8的人工腸液混合，分別在0 h、2 h、6 h、10 h、24 h取樣，按平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，按1式計算存活率［12］。

式中N1：人工胃腸液處理N個小時的活菌數(shù)；N0：0 h活菌數(shù)

1.2.3 降膽固醇能力

1.2.3.1 總降膽固醇能力 將其接種于高膽固醇MRS培養(yǎng)基中，在37℃搖床中培養(yǎng)24 h，采用硫酸鐵銨法，測定其上清液中的膽固醇濃度［14］。

1.2.3.2 BSH比活測定 采用茚三酮顯色法［15］，將其接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心用pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，之后用其調菌體濃度在OD620下值為1-2，加入25 μL、20 mmol/L的溶菌酶破壁，37℃水浴1 h。取0.1 mL上清粗酶液+1.8 mL（pH 6.0）緩沖液+0.1 mL 0.2 mmol/L的?；敲撗跄懰徕c溶液，37℃水浴30 min，加1.5 mL、15%三氯乙酸終止反應，菌液離心，取1.0 mL上清液+2.0 mL茚三酮顯色液，沸水浴15 min，在OD570測定吸光值。粗酶蛋白測定：取0.1 mL粗酶上清，加水至1 mL，加入考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，在OD595測定吸光值。

酶活力定義：每分鐘每毫升酶液反應產生的?；撬岬摩蘭ol數(shù)A。酶比活定義（U/mg）：酶活與每mL酶液所含的蛋白量（mg）之比。

1.2.3.3 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量的測定 參照文獻［16］的方法，將其接種于添加和不添加膽鹽的高膽固醇MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心后，測定上清液膽固醇濃度。取1 mL重懸菌液，加入20 μL、50 mmol/L溶菌酶及50 μL、10%SDS，37℃水浴1 h，然后超聲破碎，測定上清液膽固醇濃度，破壁后的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌，沉淀用1.5 mL無水乙醇重懸離心10 min，測定上清液膽固醇濃度，未破壁重懸菌液離心10 min，測定上清中膽固醇濃度。式中A：添加膽鹽及膽固醇的培養(yǎng)液上清中膽固醇含量；B：不添加膽鹽但添加膽固醇的培養(yǎng)液上清中的膽固醇含量；C：菌體洗滌液上清中膽固醇含量；D：菌體破壁后上清中膽固醇含量；E：破壁后菌泥用乙醇重懸浮后上清中的膽固醇含量；F：膽酸鹽與膽固醇共沉淀量；H：菌體吸收去除膽固醇量；I：不接種的添加膽鹽的培養(yǎng)基中膽固醇含量；J：細胞膜結合量。

1.2.3.4 BSH比活與降膽固醇能力的相關性分析 以BSH比活（U/mg）為Y，以降解膽固醇的含量為Xi（μg/mL），其中X1代表膽固醇與膽酸鹽共沉淀的膽固醇含量（μg/mL），X2代表菌體吸收的膽固醇含量（μg/mL），X3代表細胞膜結合的膽固醇含量（μg/mL）。

1.2.4 GABA的含量 GABA標準曲線：取配置好的 1 mg/mL GABA 標準液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 于 試管中，然后分別加入蒸餾水到1.0 mL，加入0.5 mL 0.01 mol/mL 四硼酸鈉，1.0 mL 的6%苯酚入，混勻；加入 1.0 mL 次氯酸鈉溶液，混勻后靜置8 min，沸水浴 10 min，立即冰浴 5 min，加入2.0 mL的 60%乙醇，在 OD640測量其吸光度。

GABA含量測定：取1.0 mL發(fā)酵液抽濾，置于試管中，按照上述方法測量其吸光度，并通過標準曲線計算其含量［17］。

1.2.5 抗氧化活性 樣品制備［18］：對活化后的菌種培養(yǎng)液離心10 min，分別收集菌體細胞和發(fā)酵上清液；用pH為7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體細胞，再用其對菌體細胞進行重懸，再采用低溫超聲波破碎，然后離心20 min，收集上清液作為無細胞提取物。還原力：采用鐵氰化鉀還原法［18］。超氧自由基清除率：采用鄰苯三酚自氧化法［18］。羥自由基清除率：利用Fenton反應法［18］。

1.2.6 數(shù)據處理 實驗數(shù)據重復測定3次（n= 3），結果表示為x-±s，采用 SPSS22. 0統(tǒng)計軟件進行顯著性和相關性分析。P＜0. 01表示差異有統(tǒng)計學意義，誤差線用標準誤差表示。

2 結果

2.1 乳酸菌拮抗實驗

通過牛津杯法分別對3株乳酸菌，進行兩兩之間的拮抗實驗，其結果見圖1。

圖1 拮抗實驗

由圖1可知，兩株乳酸菌在同一平板上，兩兩之間并未存在抑菌圈，表明3株乳酸菌之間均無拮抗作用，可用于制備三聯(lián)乳酸菌。

2.2 人工胃腸耐受性

乳酸菌的人工胃腸液耐受性是其發(fā)揮益生特性的重要前提，其在不同時期的人工胃腸液中的存活率如圖2。

圖2 人工胃腸耐受性

由圖2可知，三聯(lián)乳酸菌在模擬胃腸道環(huán)境中的存活率顯著高于對照組（P＜0.01）。在人工胃液中，三聯(lián)乳酸菌存活率達86.34%以上，較對照組高29.47%；轉入腸液4 h后，三聯(lián)乳酸菌和對照組的存活率均有下降趨勢，比在人工胃液時分別下降10.69%、11.35%；轉入腸液8 h后，三聯(lián)乳酸菌的存活率較對照組高39.15%；直至24 h時，三聯(lián)乳酸菌仍處于較高水平，存活率為47.88%，其活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL，較對照組高172.2%。表明三聯(lián)乳酸菌的人工胃腸液耐受力較強。

2.3 降膽固醇能力

分別測定三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇降能力、BSH比活，利用膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜降解膽固醇的含量，分析BSH比活與降膽固醇能力的相關性。

2.3.1 總降膽固醇能力和BSH比活 BSH可分解結合膽酸鹽，促進膽固醇與分解后的游離膽酸發(fā)生共沉淀或者在人體內促進膽固醇向膽汁酸轉化，達到去除膽固醇的目的，其大小可間接表明乳酸菌降膽固醇的能力。由此測定三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率和BSH比活，其結果見表1。

由表1可知，將三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后，三聯(lián)乳酸菌和對照組均有一定的降膽固醇能力，其膽固醇去除率分別為73.43%和58.21%。三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率較對照組高26.15%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。由此表明三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇能力較強。三聯(lián)乳酸菌和對照組都具有一定的BSH比活，且三聯(lián)乳酸菌的BSH比活顯著高于對照組（P＜0.01），其BSH比活為151.40 U/mg，較對照組高53.29%，與測定的膽固醇去除率一致。表明三聯(lián)乳酸菌的BSH比活較強，具有降膽固醇優(yōu)勢。

表1 三聯(lián)乳酸菌膽固醇去除率和BSH比活

2.3.2 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量 乳酸菌去除膽固醇主要依靠共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜，測定三聯(lián)乳酸菌的去除比例，結果見表2。

表2 三聯(lián)乳酸菌體外去除膽固醇分布

由表2可知，三聯(lián)乳酸菌對于膽固醇的去除主要靠共沉淀作用，其次為菌體吸收，只有少部分摻入細胞膜。其中利用共沉淀可去除56.46%的膽固醇，其膽固醇去除量為26.43 μg/mL；利用菌體細胞能去除39.62%以上的膽固醇，其膽固醇去除量為15.54 μg/mL；而只有3.9%的膽固醇能與細胞膜結合，其膽固醇去除量為1.83 μg/mL。表明三聯(lián)乳酸菌更易利用BSH分解結合膽酸鹽，通過共沉淀去除環(huán)境中的膽固醇。

2.3.3 BSH比活與降膽固醇能力的相關性分析 將三聯(lián)乳酸菌的BSH比活與其共沉淀、菌體吸收以及細胞膜結合去除的膽固醇的相關性進行分析，結果見表3。

表3 BSH比活與降膽固醇能力相關性分析

由表3可知，乳酸菌利用膽固醇與膽酸鹽共沉淀去除的膽固醇含量與BSH比活的相關系數(shù)r為0.898（P＜0.01），表明BSH比活與膽固醇和膽酸鹽共沉淀的含量成正比，乳酸菌利用菌體吸收和細胞膜結合的膽固醇含量與BSH酶比活的相關系數(shù)r為-0.528和-0.033（P＞0.01），表明乳酸菌菌體吸收和細胞膜結合的膽固醇含量不受BSH比活的影響。

2.4 GABA的含量

對三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后，測定發(fā)酵液中GABA的含量，結果見圖3。

圖3 GABA含量

由圖3可知，三聯(lián)乳酸菌和對照組均可產一定的GABA。三聯(lián)乳酸菌的GABA產量達到1.387 mg/mL，較對照組高55.59%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。GABA含量的測定對紅曲菌的研究較多，對乳酸菌研究較少。而本研究表明三聯(lián)乳酸菌具有GABA含量，可達到一定降血脂和降血壓的作用。

2.5 抗氧化活性

以還原力、超氧自由基清除率和羥自由基清除率為抗氧化活性指標，對三聯(lián)乳酸菌的菌體細胞、發(fā)酵上清液和無細胞提取物3個部位的抗氧化性進行檢測，結果見圖4。

圖4 抗氧化活性

由圖4可知，三聯(lián)乳酸菌和對照組均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其還原力和超氧自由基清除率主要存在于發(fā)酵上清液和無細胞提取物，而羥自由基清除率主要存在于菌體細胞。三聯(lián)乳酸菌總體抗氧化活性顯著高于對照組（P＜0.01）。三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力最高為1.52，較對照組高14.29%，無細胞提取物超氧自由基清除率最高為95.68%，較對照組高64.12%，菌體細胞羥自由基清除率最高為89.93%，較對照組高13.42%。因此，三聯(lián)乳酸菌具有較好的抗氧化活性。

3 討論

三聯(lián)乳酸菌有較強人工胃腸耐受能力，有利于在人體腸道內定植。乳酸菌進入人體之后，需經胃液的胃酸環(huán)境（pH 3.0）和胃蛋白酶，腸液的高膽鹽濃度（0.03%-0.3%）和胰蛋白酶后，定植于腸道，進而發(fā)揮其益生功能［9-10］。本研究中三聯(lián)乳酸菌在人工胃液中經2 h后存活率達86.34%，在人工胃腸液處理24 h后，存活率為47.88%。Goldin等［19］和趙芳等［12］研究了LGG菌株在人工胃液中處理2 h的存活率分別為62.96%和69.78%，三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強的人工胃液適應性，且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌可通過菌株間的協(xié)同作用，利用自身的雙組分信號轉導系統(tǒng)、細胞膜組成變化和維持胞內外pH平衡等機制對酸性環(huán)境進行調劑［8-9］，進而增強在人工胃液中的存活率。其次三聯(lián)乳酸菌BSH活力較強，可提高乳酸菌的腸道黏附性，而密致細胞表層蛋白也可對抗菌物質起到一定阻礙作用，由此三聯(lián)乳酸菌在人工胃腸液中的活菌數(shù)較高，適應性較強［20］。

三聯(lián)乳酸菌主要利用共沉淀和菌體吸收去除膽固醇。本研究表明三聯(lián)乳酸菌的總膽固醇去除率為73.43%，產GABA含量為1.387 mg/mL。韋云路等［21］報道長雙歧桿菌TTF的膽固醇去除率為24.8%，印伯星等［22］發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LV108的膽固醇去除率為51.93%，表明三聯(lián)乳酸菌有較強的降膽固醇能力，且顯著高于對照組。三聯(lián)乳酸菌主要通過以下幾種機制去除膽固醇：通過共沉淀作用去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌分泌的BSH比活高達151.40 U/mg，BSH可將結合膽鹽水解生成游離膽酸，進而促進膽固醇共沉淀，因此BSH比活與膽固醇共沉淀的含量成正相關；其次游離膽酸不易被腸道吸收，干擾體內的干腸循環(huán)，進而引起與膽固醇代謝相關受體的活性變化，最終降低腸道對膽固醇的吸收［4］。通過菌體吸收和少量摻入細胞膜去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌易在腸道內定植，微生物數(shù)量和生理活性相對較高，通過菌體間的協(xié)同作用可提高菌體對膽固醇的吸收，從而獲得碳源和能量，而細胞膜結合少部分膽固醇后，也可能將其同化為細胞膜的組成成分［5，23］。

三聯(lián)乳酸菌有較強抗氧化活性，其還原力和超氧自由基清除主要利用無細胞提取物，而羥自由基清除主要利用菌體細胞。清除自由基可改善體內的氧化應激，平衡體內的脂肪代謝，避免高脂血癥的形成［7］。本研究表明三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力達到1.52，超氧自由基清除率達95.68%，發(fā)酵上清液中羥自由基清除率為85.96%。何書美等［24］研究了不同品牌酸牛奶中乳酸菌液的還原力為0.7-0.8，李曉軍等［25］篩選的發(fā)酵乳桿菌La5的超氧自由基清除率為22.29%，三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強抗氧化活性，且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌耐受能力強，微生物數(shù)量多，在發(fā)酵過程中產生的胞內抗氧化物酶、螯合金屬離子的天然物質以及胞外多糖等代謝產物含量會相對增多，進而提高還原力以及對自由基的清除能力，這對高脂血癥以及心腦血管疾病的預防有著重要的意義［26］。

4 結論

三聯(lián)乳酸菌人工胃腸耐受性較好，且降膽固醇和抗氧化活性也較強。在人工胃腸液處理24 h后，存活率為47.88%，活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL；降膽固醇能力最強為73.43%，BSH比活為151.40 U/mg，GABA的含量為1.387 mg/mL；無細胞提取物的還原力和對超氧自由基清除率最高為1.52和95.68%，菌體細胞對羥自由基清除率最高為89.93%，是一種較優(yōu)的三聯(lián)乳酸菌制劑。