孟利 杜彩萍

（徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇省腦病生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心，徐州 221004）

Akt1又稱為PKBɑ，為蛋白激酶B（PKB）家族成員之一，是一種具有多種功能的蛋白激酶。Akt1由480個(gè)氨基酸組成，分布廣泛，在各組織中均有表達(dá)。Akt1的亞細(xì)胞定位受其活性的影響，非活化型Akt1主要定位在細(xì)胞胞漿中，活化型的Akt1的亞細(xì)胞定位主要是在細(xì)胞胞核和胞漿中［1］?；罨腁kt1主要通過磷酸化底物蛋白引起下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞生長、存活、增殖、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞周期調(diào)控等多種細(xì)胞活動(dòng)［2-6］。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要方式，磷酸化是Akt1活化所必需的，且Akt1完全活化依賴于其自身的第473位絲氨酸和第308位蘇氨酸的磷酸化［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，除了磷酸化，SUMO化、泛素化、糖基化等翻譯后修飾方式都對(duì)Akt1的活性產(chǎn)生影響［9-16］。而蛋白質(zhì)間相互作用也可引起蛋白活性和功能的改變，目前研究發(fā)現(xiàn)的Akt1結(jié)合蛋白已經(jīng)有很多，它們可能通過與Akt1結(jié)合影響其亞細(xì)胞定位或者改變其結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)其酶活性［17-19］。為了更加深入和直觀地揭示Akt1的翻譯后修飾及與其他分子的結(jié)合對(duì)Akt1功能的影響，需要獲得純度較高的高活性Akt1蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，采用Ni-NTA純化及透析獲得高純度和高活性的His-Akt1重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 PCR Master Mix、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System均購自Promega公司；GeneClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、EcoR I、T4 DNA ligase購 自New England Biolabs公司；LB培養(yǎng)基、LB瓊脂、PuriLink Hipure Plasmid Midiprep Kit購自Invitrogen 公司；DL10000 DNA marker 購自TaKaRa公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Plus Prestained Protein Ladder 購自Thermo公司；抗Akt1蛋白的抗體購自Cell Signaling Technology公司；胰酶、DMEM購自GIBCO公司。透析袋及夾子購自安捷倫公司。測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.2 細(xì)胞與質(zhì)粒 感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ購于Transgene公司；HEK293細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫；大鼠Akt1（全長）-pcDNA3.1質(zhì)粒由本課題組前期構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 在上游引物N末端引入6個(gè)組氨酸密碼子作為標(biāo)簽，見表1中加粗堿基，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2.2 His-Akt1重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以Akt1（全長）-pcDNA3.1重組體為模板，PCR擴(kuò)增Akt1 cDNA，用1%瓊脂糖凝膠純化目的基因。用Hind III、EcoR I酶切目的基因和pcDNA3.1，回收純化，將目的基因亞克隆入pcDNA3.1。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。將陽性重組質(zhì)粒委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序分析。

1.2.3 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。將重組質(zhì)粒及聚乙烯亞胺（PEI）分別稀釋于無血清DMEM，之后混合充分于室溫靜置15 min，將混合物加入到培養(yǎng)基。2-3 h左右換成含10%胎牛血清的DMEM，24 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 蛋白定量分析 用改良Lowry法，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，進(jìn)行蛋白濃度定量。

1.2.5 免疫印跡 取相同量的蛋白樣品加上樣緩沖液4× laemmli，沸水浴5 min變性處理。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素（NC）膜上，3% BSA室溫封閉3 h后，用抗Akt1抗體（1∶3 000）孵育過夜，Washing Buffer（10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.5）洗膜5次，每次3 min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育50 min后，washing buffer洗膜（5 min×5次），用超靈敏化學(xué)發(fā)光液顯色，BioChem 化學(xué)發(fā)光儀曝光，掃描目的條帶。

1.2.6 蛋白Ni-NTA純化 細(xì)胞超聲破碎后，于4℃1 000 ×g離心10 min，留取上清。將上清與預(yù)先平衡好的Ni-NTA于4℃ 旋轉(zhuǎn)孵育3 h。用Washing Buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑）洗滌6遍，收集沉淀，之后與 Elution Buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑）于 4℃ 緩慢混勻1 h以洗脫目的蛋白。離心，將上清放入透析袋，置于冰冷的PBS中進(jìn)行透析，每隔1 h換一次PBS，共需換約8次。最后透析袋中蛋白溶液為純化的目的蛋白。

1.2.7 考馬斯亮藍(lán)染色、脫色 SDS-PAGE分離完蛋白后，用考馬斯亮藍(lán)染液（45 mL CH3OH，45 mL ddH2O，10 mL CH3COOH，考馬斯亮藍(lán)R250：0.25 g）染40 min后，用脫色液（75 mL CH3COOH，50 mL CH3OH 加水定容至1 L）脫色，每隔1 h換一次脫色液，直至凝膠的背景由深藍(lán)色變淺至近透明。

2 結(jié)果

2.1 His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以大鼠野生型Akt1-pcDNA3.1為模板，在上游引物中引入6個(gè)His的編碼序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1-A），于1 500 bp處發(fā)現(xiàn)一條目的條帶，與His-Akt1分子量大小相符。結(jié)果表明，His-Akt1目的基因成功擴(kuò)增。

將擴(kuò)增的目的基因亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1-B），約7 000 bp處發(fā)現(xiàn)一目的條帶，分子量大小與Akt1（1 500 bp）與pcDNA3.1（5 400 bp）分子量之和一致。將上述重組體經(jīng)Hind III、EcoR I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1-C），呈現(xiàn)兩條DNA條帶，一條位于約5 000 bp處，與pcDNA3.1分子量相符；另一條位于約1 500 bp處，這與His-Akt1分子量相符。結(jié)果提示，His-Akt1成功連接入pcDNA3.1。將重組體進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示目的基因序列與Gene Bank中模板序列相一致。結(jié)果表明，His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒His-Akt1-pcDNA3.1的構(gòu)建與鑒定

2.2 His-Akt1于HEK293細(xì)胞的表達(dá)鑒定

將測(cè)序正確的His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。收集細(xì)胞樣品，用抗Akt1的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)His-Akt1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，空細(xì)胞對(duì)照組中有少量內(nèi)源性Akt1，轉(zhuǎn)染His-Akt1組有高豐度Akt1蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體可于HEK293細(xì)胞進(jìn)行高效表達(dá)。

圖2 His-Akt1重組蛋白高表達(dá)

2.3 His-Akt1蛋白純化鑒定

首先，將4 mg過表達(dá)His-Akt1的蛋白混合液經(jīng)Ni-NTA預(yù)吸附后，采用含50 mmol/L咪唑的洗液洗脫非特異蛋白，收集His-Akt1洗脫蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果（圖3-A）顯示，凝膠上除了目的條帶外，還存在較多非特異條帶。接著，分別選取0.5、1、2和4 μg洗脫蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果（圖3-B）顯示，除了His-Akt1目的條帶外，還存在非特異性條帶。結(jié)果表明，經(jīng)含50 mmol/L咪唑的洗液得到蛋白純度較低，洗脫條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 His-Akt1重組蛋白純度初步鑒定

為了獲得較高純度的目的蛋白，將過 Ni-NTA的總蛋白量減至2 mg，同時(shí)將洗液中咪唑濃度增至100 mmol/L。經(jīng)洗脫后，取洗脫蛋白進(jìn)行電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果（圖4-A）顯示，膠上除了目的蛋白，幾乎沒有非特異性條帶。免疫印跡結(jié)果（圖4-B）與此一致。結(jié)果表明，取2 mg蛋白過Ni-NTA，用含100 mmol/L咪唑洗液去除非特異性蛋白，可得到較高純度的His-Akt1。

圖4 優(yōu)化純化條件后His-Akt1重組蛋白純度初步鑒定

2.4 His-Akt1蛋白活性鑒定

將上述洗脫蛋白進(jìn)行透析純化后，分別用抗Akt1 Ser473磷酸化［p-Akt1（S473）］和Thr308磷酸化［p-Akt1（T308）］的抗體進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)His-Akt1磷酸化水平（活化水平）。結(jié)果（圖5）顯示，Akt1 Ser473和Thr308均具有較高磷酸化水平。結(jié)果表明，純化的Akt1具較高活性。

圖5 免疫印跡檢測(cè)His-Akt1 Ser473（S473）和Thr308（T308）磷酸化水平

3 討論

目前，關(guān)于Akt1活性調(diào)節(jié)的研究已有很多，主要包括磷酸化、泛素化、SUMO化修飾等。研究發(fā)現(xiàn)Akt1失活或者過度活化都與許多疾病相關(guān)，如癌癥、精神分裂癥等［20-24］。這就提示我們Akt1的活化需要一個(gè)平衡點(diǎn)，因此，關(guān)于Akt1活性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還有很多工作需要去開展。

本實(shí)驗(yàn)通過在目的蛋白Akt1的氨基端人為地加6個(gè)His的短肽作為標(biāo)簽，而6個(gè)組氨酸標(biāo)簽相較于其他標(biāo)簽，如Myc、Flag、GST標(biāo)簽有其自身的顯著優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)：6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽蛋白非常小，不會(huì)改變目的蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)；不會(huì)改變目的蛋白自身的活性；便于采用固化金屬離子親和層析。

本研究選擇pcDNA3.1真核表達(dá)載體來構(gòu)建His-Akt1重組表達(dá)載體，這與原核表達(dá)載體相比，雖然不能一次性獲得大量的蛋白，但是真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白具有高活性，并且在體外實(shí)驗(yàn)中開展關(guān)于Akt1與其他蛋白分子相互作用的研究所需的蛋白量并不是太多，而需要蛋白的純度較高。

本研究旨在獲得純化的Akt1蛋白，這就需要通過優(yōu)化純化條件，來獲得較高純度的蛋白。從圖3可以看出，在蛋白過 Ni-NTA親和吸附時(shí)，過量的蛋白混合液會(huì)增加非特異性蛋白結(jié)合的可能性。由于含不同濃度咪唑的洗液對(duì)非特異性蛋白的洗脫效果也有差別，本實(shí)驗(yàn)通過改變過 Ni-NTA的蛋白量及咪唑的濃度來優(yōu)化蛋白純化條件，提高純化效果，此操作簡(jiǎn)單、簡(jiǎn)易、有效，整個(gè)純化過程操作時(shí)間短，較高程度的降低了蛋白降解的可能性，較好地保持了蛋白本身的活性。這為進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中開展Akt1相關(guān)研究提供了新的工具。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了分子克隆手段構(gòu)建了具有高表達(dá)活性的His-Akt1-pcDNA3.1真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞表達(dá)，并通過 Ni-NTA吸附及透析獲得了相應(yīng)的高活性的純化Akt1蛋白。