谷生麗，劉諫君，孫恩濤，湛孝東，聶劉旺

(1.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

揚子鰓蛭(OzobranchusjantseanusOka，1912)是一種淡水吸血蛭類，隸屬蛭綱(Hirudinea)吻蛭目(Rhynchobdellida)鰓蛭科(Ozobranchidae)鰓蛭屬(Ozobranchus)[1]，常寄生于烏龜(Mauremysreevesii)的頸部及四肢皺褶區(qū).目前僅日本和我國有關(guān)于揚子鰓蛭分布的報道[2-3].2014年，日本學(xué)者Suzuki[4]首次報道未經(jīng)任何預(yù)處理的揚子鰓蛭經(jīng)液氮冷凍24 h后，可100%復(fù)蘇存活，且在-90 ℃的溫度下可長期存活32個月，引起了研究者極大的興趣.迄今，有關(guān)揚子鰓蛭線粒體基因組的研究甚少，Liu等[5]對揚子鰓蛭線粒體全序列數(shù)據(jù)進行了簡短報道，但沒有對其結(jié)構(gòu)進行分析；Nakano等[6]基于線粒體COX1基因分析了揚子鰓蛭的遺傳多樣性.本研究采用Pacbio三代單分子測序技術(shù)以及Illumina二代測序技術(shù)對揚子鰓蛭線粒體基因組進行測序和注釋，并與目前NCBI nucleotide數(shù)據(jù)庫中已完成測序的其他10種蛭類的線粒體基因組全序列進行比較、分析，以期為深入了解揚子鰓蛭線粒體基因組的結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)學(xué)地位提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料收集及DNA提取

本實驗用揚子鰓蛭采自安徽省無為市某龜類養(yǎng)殖場.取吸附于烏龜體表的揚子鰓蛭成蟲1只，用去離子水沖洗，經(jīng)SDS/蛋白酶K裂解，再使用酚/氯仿提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性.

1.2 Illumina和Pacbio建庫及測序

取1 μg DNA，用Covaris M220將DNA超聲打斷至300～500 bp的短片段，用TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit補平并在3’端加A，然后連接index接頭，富集DNA后進行PCR擴增.利用2%瓊脂糖回收目的條帶，TBS380定量后按比例混合上機，使用Illumina Hiseq平臺對文庫進行測序.

參照文獻[7],取1 μg DNA，用G-tubes方法將基因組處理成15～20 kb的片段，末端補平后，兩端分別加上環(huán)狀接頭，最后使用Pacbio Sequel平臺進行DNA測序.

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控及統(tǒng)計

參照文獻[8]，Illumina測序的原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic去除接頭及低質(zhì)量序列.Pacbio測序的原始數(shù)據(jù)使用SMART Analysis將bam文件格式轉(zhuǎn)化成fasta格式文件，并過濾到小于100 bp和質(zhì)量小于0.8的Polymerase reads，去除adapter序列.

1.4 線粒體基因組組裝及注釋

參照文獻[9]，利用ABySSV2.0組裝Illumina測序數(shù)據(jù)，然后利用blasR比對Pacbio三代數(shù)據(jù)，根據(jù)比對結(jié)果對單分子測序數(shù)據(jù)進行一次矯正與糾錯，最后利用糾正過的單分子測序數(shù)據(jù)與二代數(shù)據(jù)進行混合組裝.使用SPAdes挑選覆蓋深度足夠高且組裝長度較長的序列作為候選序列[10]，比對NT庫進行確認.再次利用Illumina數(shù)據(jù)進行校驗.得到完整的基因組數(shù)據(jù)之后，使用MITOS進行基因組的初步注釋[11]，再參考GenBank數(shù)據(jù)庫中相似物種的線粒體基因組數(shù)據(jù)進行最終注釋，最后使用GCview繪制基因組圖譜[12].

1.5 線粒體基因組數(shù)據(jù)比較分析

參照文獻[13]，使用MAFFT version 7在線比對揚子鰓蛭的線粒體基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中揚子鰓蛭線粒體基因組全序列(登錄號KY861060.1)之間的差異.

登錄NCBI nucleotide數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“Hirudinea mitochondrion complete genome”，以檢索蛭綱的線粒體基因組全序列.結(jié)果共檢索到11個物種的線粒體基因組全序列數(shù)據(jù)，其中Poecilobdellamanillensis和Hirudinariamanillensis為同種異名，且基因序列完全相同，故有效種為10個.下載10個線粒體基因組序列，并加入本研究所獲得揚子鰓蛭的線粒體基因組數(shù)據(jù)，進行蛭類線粒體基因組排序的比較分析.

為進一步確定揚子鰓蛭的分類地位，除下載以上全序列的10種蛭的線粒體基因組外，另加入了蛭綱中包含所有13個蛋白編碼基因(PCGs)的不完整線粒體基因組序列，它們分別為吻蛭目舌蛭科(Glossiphoniidae)的Haementeriaofficinalis和Placobdellaparasitica，無吻蛭目醫(yī)蛭科(Hirudinidae)的Hirudoverbana和Hirudomedicinalis，以及同屬于環(huán)節(jié)動物門的其他外類群——寡毛綱的Lumbricusterrestris和Perionyxexcavatus及多毛綱的Orbinialatreillii的相應(yīng)序列.參照文獻[14]，利用MEGA6.0軟件對18個物種的13個蛋白編碼基因DNA序列構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)樹并進行分析.

2 結(jié)果

2.1 揚子鰓蛭線粒體基因組的組裝

本研究采用Illumina和Pacbio平臺對揚子鰓蛭的DNA進行測序，其中：Illumina測序得到原始數(shù)據(jù)4 432 Mb，質(zhì)控之后剩余3 733 Mb，片段長度為450 bp；Pacbio得到過濾后Subreads數(shù)目為9 752，Subreads最大的長度為20 926 bp，Subreads的平均長度為3 834 bp.Pacbio的長度分布如圖1所示.

圖1 PacBio Subreads的長度分布Fig. 1 Length Distribution of PacBio Subreads

2.2 揚子鰓蛭線粒體基因組注釋

經(jīng)二代和三代數(shù)據(jù)組裝獲得揚子鰓蛭線粒體基因組序列長度為14 868 bp，A+T含量(72.4%)顯著高于G+C含量(27.6%).所有基因都在同一條鏈，即J鏈(Majoritystrand)編碼全部基因，包含13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因及1個長非編碼區(qū)(Long Non-coding Region， LNR)(圖2).經(jīng)過統(tǒng)計，揚子鰓蛭線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因占整個線粒體基因組長度的74.60%.

圖2 揚子鰓蛭線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 2 Schematic Map of the Mitochondrial Genome of O. jantseanus

本研究中揚子鰓蛭的編碼基因共存在2種起始密碼子，分別為ATG(ND5，ND4L，ND4，ND1，ND3，ND2，COX1，COX2，ATP8，ND6，CYTB，ATP6)和ATT(COX3)；終止密碼子共有4種，分別為TAA(ND5，ND4L，ND1，COX2，ATP8，CYTB，ATP6)，TAG(ND3)，TA(ND4，ND6)和T(ND2，COX1，COX3).除最長非編碼區(qū)為301 bp外，其他基因間隔共19處，最長為43 bp，其他間隔區(qū)總長度為162 bp.重疊區(qū)共6處，最大為-12 bp，總重疊區(qū)長度為-28 bp.具體結(jié)果詳見表1.

表1 揚子鰓蛭線粒體基因組注釋

2.3 基于線粒體mtDNA結(jié)構(gòu)和13個蛋白編碼基因DNA序列的蛭類系統(tǒng)發(fā)育分析

將NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中檢索到的10種蛭綱物種的線粒體基因組全序列數(shù)據(jù)信息匯總，發(fā)現(xiàn)10種蛭綱物種均隸屬于真蛭亞綱(Euhirudinea)的無吻蛭目(Arhynchobdellida)和吻蛭目(Rhynchobdellida)(表2).

表2 10種蛭綱物種的線粒體全序列基本數(shù)據(jù)

對目前已完成的10種蛭綱線粒體基因組的基因分布情況進行初步分析，結(jié)果見圖3.

圖3 蛭綱線粒體基因組基因序列差異Fig. 3 Differences in Gene Order in the Mitochondrial Genomes from the Hirudinea

如3所示，所有蛭的蛋白質(zhì)編碼基因在線粒體上的排列順序均相同，但4個tRNAs有基因位置互換現(xiàn)象.蛭綱物種線粒體基因按照排序方式的不同可分為a和b 2種類型.a型：無吻蛭目中除日本石蛭(Erpobdellajaponica)外，均呈此排列方式，ATP8和COX3中間為tRNA(G)和tRNA(Y)，16S和ND1之間為tRNA(L1)，tRNA(S2)，tRNA(A)，tRNA(L2)，最長的非編碼區(qū)(LNR)均小于100 bp.b型：所有吻蛭目物種如揚子鰓蛭以及無吻蛭目中的日本石蛭呈現(xiàn)此排列方式，即ATP8和COX3中間為tRNA(Y)和tRNA(G)，16S和ND1之間為tRNA(L1)，tRNA(A)，tRNA(S2)，tRNA(L2)，且LNR均大于299 bp.其中魚蛭屬(Zeylanicobdella)的Zeylanicobdellaarugamensis[15]的LNR達1 670 bp.

基于線粒體的13個蛋白編碼基因DNA序列的蛭類系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖4所示.

圖4 基于線粒體13個蛋白編碼基因DNA序列構(gòu)建的蛭綱物種的NJ樹Fig. 4 NJ Phylogenetic Tree of Hirudinea Species Based on 13 PCGs

由圖4可知：本研究得到揚子鰓蛭與數(shù)據(jù)庫中的揚子鰓蛭聚為一支，之后再與其他吻蛭目物種聚為一支；無吻蛭目中日本石蛭雖與其他無吻蛭目聚為一支，但其位于無吻蛭目最外側(cè)，與親緣關(guān)系較遠且同為石蛭科的八目石蛭(Erpobdellaoctoculata)之間遺傳距離也較遠.

3 討論

線粒體基因組測序?qū)τ谖锓N的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育以及生物的地理學(xué)研究具有重要的意義[16].目前發(fā)現(xiàn)環(huán)節(jié)動物的不同物種中蛋白編碼基因相對保守.在無脊椎動物中進化較為高等的環(huán)節(jié)動物的基因順序和方向具有高度保守性，這被認為是它們的原始特性[17-18].

本研究經(jīng)Illumina二代測序技術(shù)和Pacbio三代單分子測序技術(shù)獲得的揚子鰓蛭線粒體基因組全序列與GenBank中的Ozobranchusjantseanus(GenBank登錄號KY861060.1)Blast比對相似度達到99.48%，全序列長度分別為14 868 bp和14 864 bp.通過MAFFT version 7軟件比較2個序列發(fā)現(xiàn)，揚子鰓蛭線粒體基因組序列存在有8段gap，共14個位點，均位于非蛋白編碼區(qū)；共有57個突變位點，其中11個位點涉及氨基酸編碼的改變，ND4和ND6分別有2個，ND4L，ND1，COX1，ATP8無氨基酸變化，其余7個蛋白編碼基因僅1個氨基酸的改變.另外，本研究揚子鰓蛭線粒體基因組全序列與GenBank中的Ozobranchusjantseanus在基因位點的劃分方面也存在較多差異.如COX2的長度分別是684 bp和676 bp，后者缺少2個氨基酸和終止密碼子；COX3分別是787 bp和781 bp，后者缺少2個氨基酸且無起始密碼子.

本研究所采用的測序技術(shù)為Pacbio三代單分子測序技術(shù)和Illumina二代測序技術(shù)，該技術(shù)具有讀取片段長和準確率高的特點[19-20].本研究表明，Subreads最大可達20 926 bp，所有候選序列長度均大于10 kb，可糾正步移法和Illumina二代測序可能產(chǎn)生的線粒體假基因[21]的偏差.通過以上可靠、高效的測序手段，筆者對揚子鰓蛭的線粒體基因組進行測序并組裝，獲得了高度精確的揚子鰓蛭mtDNA，并且對測序獲得的揚子鰓蛭的線粒體基因組進行了較為詳細的注釋，通過軟件分析結(jié)合近緣物種的比較，糾正了一些基因位點的不正確劃分[5]，尤其是蛋白基因，更加準確地確定了揚子鰓蛭功能基因的位點.

筆者對10種蛭綱物種的線粒體基因排列進行比較分析并歸類，首次發(fā)現(xiàn)蛭綱內(nèi)物種的線粒體tRNA的排列方式有2種.有研究指出線粒體基因順序在研究系統(tǒng)發(fā)生方面有著重要的作用，越相近的種相應(yīng)的線粒體基因的順序也越趨于一致[22-23].筆者歸類的2種排列方式也與非編碼區(qū)的長度以及基于線粒體的13個蛋白編碼基因DNA序列所構(gòu)建的NJ樹的聚類較為一致，但是聚類結(jié)果與最近報道的通過進化分析發(fā)現(xiàn)的揚子鰓蛭聚類于無吻蛭目的研究結(jié)果[5]有根本的差別.本研究再次證明揚子鰓蛭無論在形態(tài)學(xué)分類還是在線粒體基因排列方式和NJ樹進化分析上，都與吻蛭目物種聚為一類.另外，無吻蛭目中石蛭科的日本石蛭線粒體基因的排列方式為b型，在基于13個PCGs基因構(gòu)建的NJ樹分析中，日本石蛭與其他無吻蛭目以及同為石蛭科的八目石蛭的親緣關(guān)系較遠，說明石蛭科物種可能非單系起源，是否為有效種值得進一步分析研究.

目前，揚子鰓蛭作為蛭綱中報道的唯一能夠耐受低溫冷凍的蛭[4]，是蛭綱中的一個特例，但是關(guān)于揚子鰓蛭分子研究的報道僅有2篇[5-6].而非洲揺蚊幼蟲和緩步蟲作為耐低溫和天體生物學(xué)研究中的模型生物[24-25]，相關(guān)研究報道涉及形態(tài)、生理、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等多方面[26-27].揚子鰓蛭與非洲揺蚊幼蟲、緩步蟲相比體積更大[1]，在今后的耐超低溫以及凍后修復(fù)機制研究中具有更好的應(yīng)用前景.在生物冷凍后的解凍過程中，組織會出現(xiàn)缺血缺氧和再灌注等損傷[28]，由此引起的一系列功能改變均與線粒體代謝密切相關(guān)[29].因此，對于揚子鰓蛭線粒體的后續(xù)研究以及蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的研究，可能會為人類探究低溫休眠的生物鐘調(diào)節(jié)機制，并最終實現(xiàn)整個生物體的冷凍保存及復(fù)蘇提供幫助.