張娟麗 曲守方 孫楠 張文新 孫晶 于婷★ 黃杰★

耳聾是一種普遍高發(fā)的聽力障礙性疾病，病因復(fù)雜。環(huán)境因素、遺傳因素均可導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，其中至少有50%的學(xué)語前耳聾是由遺傳因素導(dǎo)致的。大多數(shù)遺傳性耳聾是由幾個(gè)較為常見的熱點(diǎn)突變引起的［1-2］，其中中國人群常見耳聾突變主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體的12S rRNA基因突變［3-5］。目前有多種耳聾基因突變檢測試劑盒，方法包括芯片法、熒光PCR 法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、測序法等。由于各試劑盒的檢測原理、檢測的突變位點(diǎn)及數(shù)量存在一定差異，需要對這類試劑盒的性能指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)一尺度的評價(jià)，來保障臨床樣本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。建立耳聾基因突變檢測試劑盒的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)就勢在必行。中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱本院）已完成熒光PCR 法、微陣列芯片法、測序法等多個(gè)耳聾基因檢測試劑盒的注冊檢驗(yàn)，具有豐富的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，并且在2017年研制完成耳聾基因突變檢測國家參考品［6］，為該類試劑盒的注冊檢驗(yàn)提供了可靠的參考品，該參考品已經(jīng)在全國范圍內(nèi)使用了近2年。本院聯(lián)合1 家省級醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)及7 家企業(yè)開展了建立耳聾基因突變檢測試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的工作，現(xiàn)將該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證情況作一簡要匯報(bào)。

1 材料與方法

1.1 試劑盒

十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒（微陣列芯片法），北京博奧生物有限公司生產(chǎn)；九項(xiàng)耳聾基因檢測試劑盒（生物芯片法），北京博暉創(chuàng)新生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；耳聾易感基因檢測試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法），潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)；先天性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR 法）、藥物性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR法）和PDS 基因檢測試劑盒（熒光PCR 法），濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；四項(xiàng)耳聾基因檢測試劑盒（ARMS-PCR 法），中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；二十項(xiàng)遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒（飛行時(shí)間質(zhì)譜法），廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；耳聾基因突變檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法），華大生物科技（武漢）有限公司；遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（測序法），廣州市金圻睿生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 參考品

耳聾基因突變檢測國家參考品：批號：360013-201701，包含20 個(gè)陽性參考品（P1-P20）和3 個(gè)陰性參考品（N01～N03）。除P19 和P20 為DNA 樣本外，其余參考品均為干血片。重復(fù)性參考品由各試劑廠家自行提供。

1.3 主要檢測儀器

10K-B 微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司）、核酸芯片檢測儀（北京博暉創(chuàng)新生物技術(shù)股份有限公司）、HB 2012A 導(dǎo)流雜交儀（潮州凱普生物化學(xué)有限公司）、ABI 7300 熒光PCR 儀（美國ABI 公司）、Bio-Rad S1000PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）、DR MassARRAY 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）、BGISEQ-500基因測序儀（華大生物科技（武漢）有限公司）、BioelectronSeq 4000 基因測序儀（東莞博奧木華基因科技有限公司）。

1.4 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中各技術(shù)指標(biāo)及驗(yàn)證方法

在充分調(diào)研并分析各試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的前提下，結(jié)合臨床應(yīng)用情況，按照GB/T1.1 2009 的要求，制定了耳聾基因突變檢測試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)容包括前言、范圍、規(guī)范性引用文件、要求、試驗(yàn)方法、標(biāo)簽和使用說明書以及包裝、運(yùn)輸、貯存7 個(gè)條款。其中“要求”和“試驗(yàn)方法”是核心內(nèi)容，要求中包含外觀、檢測限、準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性。

1.4.1 外觀

在自然光下目視檢查。制造商應(yīng)根據(jù)自己產(chǎn)品的包裝特點(diǎn)規(guī)定適當(dāng)?shù)耐庥^要求。一般應(yīng)有試劑盒各組分組成、性狀；內(nèi)外包裝、標(biāo)簽清晰等的要求。

1.4.2 檢測限

應(yīng)包括試劑盒檢測范圍內(nèi)的全部基因型別。按照說明書中的操作方法，取國家陽性參考品中未包含的試劑盒檢測范圍內(nèi)突變位點(diǎn)的企業(yè)檢測限參考品，以及取試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品稀釋至試劑盒聲稱濃度后，各檢測1 次；或取企業(yè)檢測限參考品，各檢測1 次，均要求檢出相應(yīng)的基因型別。

1.4.3 準(zhǔn)確性

應(yīng)包括試劑盒檢測范圍內(nèi)的全部基因型別。按照說明書中的操作方法，取國家陽性參考品中未包含的試劑盒檢測范圍內(nèi)突變位點(diǎn)的企業(yè)陽性參考品，以及取試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品，各檢測1 次；或取企業(yè)陽性參考品，各檢測1次，均要求檢出相應(yīng)的基因型別。

1.4.4 特異性

按照說明書中的操作方法，取國家陰性參考品和試劑盒檢測范圍外的國家陽性參考品，各檢測1 次；或取企業(yè)陰性參考品，各檢測1 次，結(jié)果均應(yīng)為陰性或野生型。

1.4.5 重復(fù)性

根據(jù)試劑盒檢測范圍內(nèi)的基因種類及突變類型來確定重復(fù)性參考品，每種基因至少選擇1 個(gè)突變位點(diǎn)/類型。按照說明書中的操作方法，取企業(yè)重復(fù)性參考品，重復(fù)檢測10 次，結(jié)果應(yīng)一致且應(yīng)檢出相應(yīng)的基因型別。

2 結(jié)果

2.1 外觀

全部試劑盒外觀均滿足要求。

2.2 檢測限

將試劑盒檢測范圍內(nèi)國家陽性參考品稀釋至1 ng/μL，大部分廠家的試劑均可檢出，僅廠家E 在檢測1 ng/μL 濃度的國家參考品時(shí)，在1494 反應(yīng)體系檢出P4、P6、P16、P19、N03 異常，P12 突變，而未能檢出P20 突變；在SLC 反應(yīng)體系檢出P4、P15、N01 異常，P12 突變，而未能檢出P11 的IVS7-2 突變；在GJB 反應(yīng)體系檢出P4、P15、N01 異常，多個(gè)國家參考品檢出235delC 突變；以上考慮為樣本濃度低于試劑盒聲稱檢測限所導(dǎo)致的結(jié)果異常，后按照試劑盒的檢出限稀釋樣本至5 ng/μL 時(shí)，均可檢出。

根據(jù)以上檢測結(jié)果以及網(wǎng)上征求意見和多次會議討論，最終確定檢測限指標(biāo)如下：對于芯片法，檢測限應(yīng)不高于20 ng/反應(yīng)或2 ng/μL；對于質(zhì)譜法，檢測限應(yīng)不高于5 ng/反應(yīng)或1 ng/μL；對于熒光PCR 法，檢測限應(yīng)不高于10 ng/反應(yīng)或2 ng/μL，若PCR 擴(kuò)增后采用化學(xué)顯色或者電泳-凝膠成像等方法對結(jié)果進(jìn)行判讀的試劑盒，檢測限應(yīng)不高于15 ng/反應(yīng)或1 ng/μL；本行標(biāo)中未涉及到其他原理試劑盒的檢測限可參考以上進(jìn)行設(shè)定；并且檢測結(jié)果可僅滿足總反應(yīng)量或者濃度兩個(gè)指標(biāo)之一；對于mtDNA12S rRNA突變百分比的檢測限暫不做要求，企業(yè)可根據(jù)臨床樣本實(shí)際突變百分比，進(jìn)行系列稀釋，自行確認(rèn)試劑盒的突變百分比檢測限。

2.3 準(zhǔn)確性

大部分廠家結(jié)果滿足要求。除已知突變外，廠家C 還檢出國家參考品P19 的299M 雜合突變，國家參考品P9、P16 的1555 突變，不滿足要求。

2.4 特異性

大部分廠家結(jié)果滿足要求。廠家C 檢出國家陽性參考品P14（突變位點(diǎn)為試劑盒檢測范圍外，作為陰性參考品使用）存在1555 突變，不滿足要求。

2.5 重復(fù)性

檢測企業(yè)重復(fù)性參考品，結(jié)果均滿足要求。由于存在多種檢測方法的試劑盒，雖均為定性產(chǎn)品，但是部分試劑盒可以產(chǎn)出用于計(jì)算變異系數(shù)的數(shù)據(jù)，因此，最終確定的要求也有所不同，要求：①對于質(zhì)譜法、芯片法等檢測原理的試劑盒，以及PCR 擴(kuò)增后采用化學(xué)顯色或者電泳-凝膠成像等方法對結(jié)果進(jìn)行判讀的試劑盒，重復(fù)性參考品的檢測結(jié)果應(yīng)一致且型別準(zhǔn)確；②對于熒光PCR 法檢測試劑盒，重復(fù)性參考品的檢測結(jié)果應(yīng)型別準(zhǔn)確，且相應(yīng)檢測通道Ct 值（或Tm 值或關(guān)鍵性判讀指標(biāo)）的變異系數(shù)（CV%）應(yīng)不大于5.0%。

3 討論

運(yùn)用分子診斷技術(shù)檢測耳聾基因突變位點(diǎn)的檢測方法較多，除傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性法以外，還有：①一代測序技術(shù)，Sanger 測序目前仍為基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但成本高、耗時(shí)長、對操作人員要求高；②基因芯片技術(shù)，具有自動化、高通量、微型化，結(jié)果判讀方便，但對樣本DNA 質(zhì)量要求高，且可檢測的突變位點(diǎn)有限；③基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，具有準(zhǔn)確高效、檢測位點(diǎn)多等特點(diǎn)，但該技術(shù)對樣品純度要求更高、儀器昂貴、對人員技術(shù)要求高；④下一代測序（NGS）技術(shù)，通過大量數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析手段來判定，具有通量更高、速度更快等優(yōu)點(diǎn)。此外，還有高分辨率熔解曲線技術(shù)、侵染檢測技術(shù)、多色探針熔解曲線分析技術(shù)等，上述方法各有優(yōu)劣［7-11］。目前已有多家企業(yè)根據(jù)自己的技術(shù)優(yōu)勢及實(shí)際情況，研發(fā)了多種耳聾基因突變檢測試劑，主要為測序法、芯片法、質(zhì)譜法、PCR 法。國內(nèi)已上市銷售的耳聾基因突變檢測試劑盒有9 個(gè)，尚有多家企業(yè)正在進(jìn)行相關(guān)工作。這些試劑在臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，超過60 萬新生兒受益。然而各類試劑盒因檢測原理、檢測位點(diǎn)和檢測能力范圍不同，存在一定技術(shù)水平差異，2019年之前并無這類試劑盒的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)，客觀上無法進(jìn)行統(tǒng)一尺度的評價(jià)，所以本院開展了耳聾基因突變檢測試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的申報(bào)。

本次行標(biāo)起草單位及驗(yàn)證單位覆蓋了國內(nèi)耳聾基因突變檢測試劑盒的主流廠家，方法也全面覆蓋，其優(yōu)勢在于意見來源廣泛且驗(yàn)證數(shù)據(jù)充分，使確定的各指標(biāo)更加嚴(yán)謹(jǐn)、更具可操作性。在檢測限項(xiàng)目中，由于各方法原理本身的限制，個(gè)別試劑在樣本濃度為1 ng/μL 的條件下，難以正確檢出突變位點(diǎn)，此時(shí)可考慮適當(dāng)提高檢測限濃度，但并不直接提高至該檢測試劑盒聲稱的檢測限。這樣做的目的是，既不違背現(xiàn)有試劑盒的客觀檢測水平，同時(shí)可促進(jìn)企業(yè)改進(jìn)方法，提高檢出率。在準(zhǔn)確度和特異性項(xiàng)目中，個(gè)別試劑出現(xiàn)了假陰性和假陽性的結(jié)果。出現(xiàn)以上情況，企業(yè)應(yīng)積極查找原因，解決問題。這也是建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的意義所在。要指出來的是，在制定過程中，有以下幾個(gè)討論熱點(diǎn)問題：①適用范圍：由于測序法與PCR 或者芯片法等方法的檢測原理存在一定差異，有其特征性的性能指標(biāo)，如建庫失敗率，測序深度、測序質(zhì)量評價(jià)等，不完全適用本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用范圍，故經(jīng)討論，去掉適用范圍中的基于測序原理的耳聾基因突變檢測試劑盒；②檢測限項(xiàng)目中：a.對于線粒體異質(zhì)性的確認(rèn)受限于目前的檢測技術(shù)，以及臨床陽性樣本的難以獲得性，不列為評價(jià)指標(biāo)。b.對于其他位點(diǎn)的突變，因各檢測方法原理不同，分別確定檢測限指標(biāo)，并通過實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)；c.干血片提取后的DNA 含量一般較低，質(zhì)量較差，各試劑檢測原理及上樣量不同，如果按提取總量制定檢測限指標(biāo)，并不能客觀地評估試劑盒的檢測能力，最終選擇總反應(yīng)量或濃度來評價(jià)試劑盒的檢測限；不再對重復(fù)性參考品的性質(zhì)描述為強(qiáng)/中陽性和弱陽性，改為根據(jù)突變基因種類設(shè)置重復(fù)性參考品。

綜上所述，該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)正式發(fā)布以后，與耳聾基因突變檢測國家參考品配合使用，將有助于促進(jìn)各廠家改進(jìn)檢測能力，提高試劑質(zhì)量，有效提高耳聾患兒的檢出率，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。同時(shí)，將為該類產(chǎn)品的研制、檢測檢驗(yàn)及上市后的監(jiān)管工作提供必要的技術(shù)指導(dǎo)和依據(jù)。