李 達，王 軍，楊 忠，王會如

(1.北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京101111； 2.清華大學生命科學學院，北京100084)

1 引 言

人類基因組計劃的實施，推動了分子生物學技術在醫(yī)學和遺傳學基礎研究領域的應用。隨著基因組序列信息的不斷完善，人們對疾病的認識逐步深入到分子層面，分子檢測結(jié)果在臨床診斷指導中的作用越來越受到重視。雖然我國分子診斷產(chǎn)品市場占有率較小，但從2014年開始，每年的增速超過20%，成為體外診斷行業(yè)中發(fā)展最快的產(chǎn)品[1]。2015年，我國開展并實施了自己的“精準醫(yī)療”計劃，由北京協(xié)和醫(yī)院、中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院、北京大學人民醫(yī)院等作為第一批運用高通量基因測序技術進行腫瘤診斷與臨床治療的試點單位[2]。分子診斷行業(yè)產(chǎn)品涉及無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、癌癥早篩及伴隨診斷、耐藥基因檢測、血液病檢測、遺傳易感基因檢測、生殖醫(yī)學檢測和致病微生物檢測等。隨著基因測序數(shù)據(jù)和臨床病例的結(jié)合，疾病在分子水平呈現(xiàn)出了相同的機制，如非小細胞肺癌患者中，腫瘤體細胞中出現(xiàn)EGFR、KRAS和TP53基因的突變[3]，乳腺癌患者體細胞中發(fā)現(xiàn)BRCA1、BRCA2和HER2突變[4,5]。從堿基水平來看，基因的變異類型主要有拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)、單核苷酸堿基突變(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、小片段堿基的插入或缺失(insertion-deletion, Indel)、基因融合、基因重排和甲基化修飾等。

隨著分子體外診斷行業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)品種類和數(shù)量與日俱增。然而，不同廠家產(chǎn)品的性能參差不齊，保證檢驗結(jié)果的可靠性需要依靠正確的參考方法和標準物質(zhì)，通過溯源來實現(xiàn)標準化和一致化。目前，分子檢測產(chǎn)品主要以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)、生物質(zhì)譜、分子雜交和測序法為主。市場上常見的核酸定值平臺有分光光度計、熒光染料定量儀、熒光定量PCR儀、數(shù)字PCR儀、雜交芯片、飛行質(zhì)譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜和第二代高通量測序儀等。而核酸標準物質(zhì)一般由各國政府機構(gòu)和非盈利組織研制開發(fā)，大多采用多實驗室合作定值方案。美國國家標準與技術研究院以熒光定量PCR和數(shù)字PCR作為定值的平臺，研制了人巨細胞病毒(RM 2366a)、人類DNA定量標準品(RM 2372a)、HER2基因拷貝數(shù)(RM 2373)等標準物質(zhì)[6,7]；英國國家生物標準研究所研制的骨髓增殖性腫瘤驅(qū)動JAK2基因V617F突變標準品盤，采用了熒光定量PCR、數(shù)字PCR、生物質(zhì)譜和高通量測序儀等作為定值的平臺[8]。目前由于核酸標準物質(zhì)的需求量大，商業(yè)公司紛紛進駐標準物質(zhì)研制領域，如英國Horizon Diagnostics公司生產(chǎn)的高通量測序人類基因組分子診斷標準物質(zhì)。該標準物質(zhì)同樣以數(shù)字PCR作為定值手段，根據(jù)不同測序平臺和文庫構(gòu)建方式，基于基因覆蓋率開發(fā)了不同等位基因頻率的標準物質(zhì)[9]。

核酸檢測的優(yōu)勢在于從分子層面揭示了疾病的成因，但樣品中較低的核酸濃度通常給檢測帶來了困擾。目前，分子診斷產(chǎn)品的性能和實際檢測能力的正確評價，需要利用均勻穩(wěn)定且量值可溯源的標準物質(zhì)[10]。而核酸標準物質(zhì)的研制過程，不僅需要正確地使用核酸檢測儀器和試劑產(chǎn)品，更需要合理規(guī)范的實驗設計和操作流程。本文從核酸的取樣量、核酸的稀釋、核酸定值方法和數(shù)據(jù)結(jié)果分析4個方面展開，探討核酸標準物質(zhì)定值的影響因素。

2 實驗體系要點

2.1 核酸取樣量

核酸作為生物體遺傳信息的載體，存在于人體的各類生物樣本中，如腫瘤組織細胞、血液白細胞、血漿、尿液、唾液和胸腹液等。從各種樣本中提取核酸并進行檢測，涉及到復雜的提取過程和隨機取樣過程。為了盡可能得到核酸，我們應盡量多收集樣本。然而，臨床樣本的特殊性，限制了樣本本身的取樣量，從而進一步影響了被測樣本的準確性。尤其是體液中游離核酸的檢測，因樣本取樣量的限制，對檢測結(jié)果造成很大的影響。依據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)和分子量，將核酸質(zhì)量換算成各物種核酸分子的拷貝數(shù)。如表1所示，在相同質(zhì)量的樣本下，樣本基因組的大小與核酸拷貝數(shù)成反比，基因組越大，相同質(zhì)量的核酸所含有的拷貝數(shù)越少。

表1 1 ng核酸分子拷貝數(shù)估計Tab.1 Estimation of copy number in 1 ng nucleic acid molecules

*艾滋病病毒為RNA病毒。

在做核酸檢測時，檢測的目標分子往往是稀有拷貝，這給樣本的取樣造成了很大的困擾。貝努利模型給出了檢測的核酸分子數(shù)量與置信區(qū)間的關系：

Φ(μ,m)=1-(1-μ)m

(1)

式中：Φ為置信區(qū)間；μ為目標分子比例；m為檢測分子數(shù)。

圖1展示了在不同目標分子比例下，所需檢測的核酸分子數(shù)量與置信區(qū)間的關系。

圖1 檢測分子數(shù)與置信區(qū)間的關系Fig.1 The relationship between the detecting molecular numbers and confidence intervals

當要求達到95%的置信區(qū)間，目標分子所占比例為1%時，至少要檢測299個分子才能保證檢測到1個目標分子；而要達到99%的置信區(qū)間，則至少需要檢測459個分子才能保證檢測到1個目標分子。假如目標分子比例不變，理論上檢測500個分子中應該有5個目標分子被檢測到，然而在實際的測量值有可能是4個或6個目標分子，最終用多次測量值的均值代表檢測結(jié)果。

由于定量通常使用多次測量值來估計真實值，我們用變異系數(shù)來衡量測量值的離散程度，要求測量值有較小的誤差。變異系數(shù)的表達式為：

(2)

式中：p為目標分子比例；n為檢測分子數(shù)。

圖2給出了5個不同比例的目標分子數(shù)下，測量的分子數(shù)與變異系數(shù)的關系曲線。

圖2 測量的分子數(shù)與變異系數(shù)的關系Fig.2 The relationship between the quantitating molecular numbers and coefficient of variation

可以看出，隨著測量分子數(shù)目的增加，變異系數(shù)逐漸減小，測量相同的分子數(shù)下，目標分子所占比例越高，變異系數(shù)越小。當目標分子所占比例為1%時，測量大于39 600個分子時，變異系數(shù)小于5%；而當目標分子所占比例為0.1%時，則需測量99 900個分子，變異系數(shù)才能降低到10%。因此，檢測的樣本和變異系數(shù)決定了實際的工作量。

稀有核酸樣品對取樣體積有著更高的要求，取樣體積的大小直接影響著取樣的均勻性，從而影響測量的正確性。如圖3所示，假設樣品中僅含有16個目標分子時，若按總體積的1/64取樣，每次取到的突變分子數(shù)為0至2個；按總體積的1/9取樣時，每次能取到1至3個突變分子；而只有按總體積的1/4取樣時，每次取樣才能得到一致的4個目標分子。所以，為保證取樣的均勻性，稀有核酸分子的取樣體積要盡可能大，甚至接近樣品本身體積。

圖3 稀有核酸樣品的均勻性差異Fig.3 The uniformity differences of rare nucleic acid samples

2.2 核酸的稀釋

為保證核酸檢測的正確度、精密度和準確度，核酸檢測儀器和試劑都限定了不同的核酸上樣體積或上樣量。在樣品的制備過程中，核酸的稀釋成為不可缺少的試驗步驟。如圖4所示，樣品的稀釋倍數(shù)和取樣體積之間存在著緊密聯(lián)系。假設100 ng/μL的人類基因組DNA樣品，樣品總體積為20 μL，按照1:10的比例梯度稀釋DNA。不同的取樣體積決定了樣品可稀釋的倍數(shù)。當取樣體積為0.5 μL時，僅能稀釋到1 500倍；而取樣體積為10 μL時，能夠稀釋到30 000倍。由此可見，在一定的核酸濃度下，取樣體積的大小應根據(jù)稀釋倍數(shù)合理設定。

核酸稀釋的另一個重要因素是移液誤差，它影響取樣量的準確度。假設一支10 μL移液槍的誤差為±0.02 μL，當取樣體積為10 μL時，取樣誤差的絕對值僅為0.2%；而取樣量為0.5 μL時，取樣誤差的絕對值可達4%。隨著移液次數(shù)的增加，取樣誤差逐漸積累；稀釋次數(shù)的增加，同樣也增大了取樣的誤差。所以，較大的取樣體積、較少的移液次數(shù)和稀釋次數(shù)，是提高取樣準確度的有效手段。

2.3 定值方法的選擇

在基因檢測中，不同的技術方法可以得到不同的核酸量值，表2介紹了6種常用的核酸定值技術。

表2 基因檢測常用的核酸定值方法Tab.2 Common methods for quantitation of nucleic acids in genetic testing

圖4 取樣體積和稀釋倍數(shù)之間的關系Fig.4 The relationship between sampling volume and dilution factor

賽默飛世爾公司生產(chǎn)的NanoDrop和Qubit核酸定量儀，通過核酸對光譜的吸收原理，能夠簡單快速地定量核酸[11]；熒光定量PCR技術由Applied Biosystems公司首先推出，該技術在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個PCR進程，通過產(chǎn)生的可被檢測到的熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，即Ct(cycle-threshold)值，來做標準曲線，定量核酸分子數(shù)[12]；2012年，Bio-Rad公司推出了第一款商用微滴式數(shù)字PCR儀，該儀器為直接計數(shù)法，將待測樣本稀釋，可以將反應單元中的DNA模板達到單分子水平。通過PCR擴增，具有熒光信號的反應單元中至少含有一個拷貝分子[13]。生物質(zhì)譜的發(fā)展基于軟電離方式，1990年，AB SCIEX公司推出了第一款基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)。質(zhì)譜在準確性方面具有優(yōu)勢， 通過等位基因特異延伸反應得到較短的寡核苷酸片段，檢測寡核苷酸的分子量來確定樣本的SNP和Indel，再通過質(zhì)譜峰單位面積定量核酸[14]；高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high-resolution inductively-coupled plasma-mass spectrometry, HR-ICP-MS)對痕量和超痕量元素具有良好的檢測能力以及譜圖識別性能，以磷元素來定量核酸具有很好的分辨率[15]；1997年，斯坦福大學研制出了第一張酵母全基因組芯片，基因芯片基于核酸分子堿基互補配對原理，通過合成特定的寡核苷酸序列，利用雜交過程產(chǎn)生不同強度的熒光信號值來定量核酸[16]；羅氏454測序系統(tǒng)開啟了新一代的DNA測序儀市場，下一代測序技術一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，通過對測序上樣文庫的定量，運用生物信息學分析技術，幾乎可以得到樣本里所有的核酸序列和豐度[17]。

不同方法有各自的儀器平臺的優(yōu)缺點，表2中總結(jié)了基因檢測中常用的6種技術平臺。其中，數(shù)字PCR方法由于不需要借助任何的標準品即可進行核酸的絕對定量，且在低豐度檢測時具有更高的準確性[18]，越來越被廣泛接受為核酸溯源定值的標準參考方法。

2.4 數(shù)據(jù)結(jié)果分析

數(shù)據(jù)處理過程中，我們在判斷陽性或陰性樣品時，常常碰到假陽性和假陰性問題，如圖5中指出的第I類錯誤和第II類錯誤。根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI)EP17-A文中定義，由于實驗過程的復雜性，空白樣品有時會產(chǎn)生一個低值信號。當樣品的濃度非常低時，低于空白限(limit of blank, LoB)，容易產(chǎn)生假陰性?？瞻紫抻啥啻沃貜偷挠行蠘恿康年幮詷悠返臄?shù)值來確定，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，空白限應根據(jù)式(3)確定數(shù)值。另外，由于系統(tǒng)誤差的存在，實際的空白限設定應大于計算得到的空白限。

(3)

圖5 空白限、檢測限和定量限的關系分布Fig.5 Distribution relationship between LoB, LoD and LoQ

檢測限(limit of detection, LoD)是能夠真實區(qū)分空白限并能夠得到合理的檢測結(jié)果的樣品最低濃度或起始量，標志著實驗體系的最低檢測能力。式(4)明確了檢測限的計算方法。

LoD=LoB+1.645×SDLCsample

(4)

式中：SDLCsample為低值濃度樣本標準差。

核酸定量要達到定量限(limit of quantitation, LoQ)的要求，定量限是指滿足準確度、精密度和總誤差的樣品最小檢測濃度或起始量。定量限一般要大于檢測限，有時在數(shù)值上也可以等于檢測限[19]。定量限的確定要考慮定量實驗體系和測試樣品的特點，測量值的標準差和線性相關系數(shù)是確定定量限的兩個重要因素。一旦線性關系確立，就可以通過回歸模型反推測量值代表的樣品濃度或上樣量。如圖6所示，在定量限以上，測量值的標準差有明確的數(shù)值范圍。隨著樣品濃度或上樣量的增加，測量值的標準差逐漸減小，達到最小范圍，即最佳定量范圍，而只有在最佳定量范圍內(nèi)測量值才能更接近真實值。

圖6 定量的準確度與線性回歸分析Fig.6 The relationship between quantitative accuracy and linear regression analysis

我們以數(shù)字PCR定值方法為例，參考市場上常見的數(shù)字PCR儀型號。根據(jù)Dube等[20]人的研究，在95%的置信區(qū)間下，利用式(5)～式(9)模擬了5個不同數(shù)目的反應單元下，反映單元內(nèi)平均分子數(shù)與相對誤差的關系。如圖7所示，隨著反應單元數(shù)目的增多，相對誤差逐漸降低。當反映單元內(nèi)平均分子數(shù)為1.59時，對應的相對誤差全部達到了最低值。即λ=1.59為數(shù)字PCR的最佳定量范圍。

(5)

(6)

λmin=-ln(1-pmin)

(7)

λmax=-ln(1-pmax)

(8)

(9)

式中：λ為單元內(nèi)平均分子數(shù)；λmin為單位內(nèi)最小分子數(shù)；λmax為單位內(nèi)最大分子數(shù)；p為平均陽性單元比例；pmin為最小陽性單元比例；pmax為最大陽性單元比例；C為單元數(shù)目；δ為相對誤差。

圖7 數(shù)字PCR反應單元中平均拷貝數(shù)與相對誤差的關系Fig.7 The relationship between average number of copies per droplet and relative error in digital PCR

利用泊松分布計算單元內(nèi)實際分子數(shù)為k的概率：

(10)

如圖8所示，當λ=1.59時，實際的反映單元內(nèi)為1個真實分子數(shù)的概率最大，為32.4%。

圖8 變異系數(shù)最小時反應單元內(nèi)含有不同分子數(shù)的概率Fig.8 The probability of average number of copies per droplet in minimum coefficient of variation

3 結(jié) 語

隨著PCR技術的問世，以核酸為基礎的生命科學研究和臨床分子診斷得到了廣泛應用。最早的核酸標準物質(zhì)始于丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)RNA(NIBSC code 06/202；06/206)[21]，自此醫(yī)學檢驗科室和試劑廠家采用國際標準物質(zhì)進行定量，建立了統(tǒng)一的定量單位，使得檢測結(jié)果不僅具有可比性，而且有了溯源性，保證了臨床檢測結(jié)果的可靠性。

2017年11月，美國食品和藥物管理局批準的高通量測序平臺，能夠一次對病人腫瘤中468個基因的突變和遺傳變異進行快速、靈敏的檢測。以高通量測序技術為依托的分子類體外診斷試劑和儀器產(chǎn)品的飛速發(fā)展，將傳統(tǒng)的單一核酸檢測項目逐步推向了全基因組水平的檢測。隨著分子診斷產(chǎn)品認可度的提高，分子診斷檢測將有望從體細胞基因組、游離核酸逐步向代謝水平的核酸檢測發(fā)展，屆時核酸定值的重要性會越發(fā)突出[22]。因此，核酸標準物質(zhì)的研制也面臨著極大的挑戰(zhàn)。

本文重點介紹了核酸標準物質(zhì)研制實驗過程中取樣量、稀釋、定值方法和數(shù)據(jù)結(jié)果分析4個關鍵因素，為合理優(yōu)化實驗體系、減小實驗誤差和避免錯誤結(jié)果提供了理論依據(jù)。但核酸標準物質(zhì)的研制不僅要考慮實驗設計，還要考慮制作工藝，滿足標準物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、互換性和基質(zhì)效應等要求[23]。另外，標準物質(zhì)需要規(guī)定用途范圍和適用儀器特點，在行業(yè)內(nèi)具有實用性，能夠起到規(guī)范和統(tǒng)一行業(yè)標準的作用。希望本文工作能夠指導核酸標準物質(zhì)的定值實驗設計，為完善核酸標準物質(zhì)的研制提供參考。