馮曉東，程芳芳，郭 軍，王喜良，周榮興 (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷二科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

臨床上，由創(chuàng)傷、感染、骨腫瘤切除、先天畸形等各種原因所致的骨缺損在骨科領(lǐng)域尤為常見。幾個(gè)世紀(jì)以來骨缺損修復(fù)一直是骨科臨床、生物力學(xué)、材料學(xué)以及組織工程學(xué)等領(lǐng)域共同關(guān)注并不斷深入研究的重要課題。傳統(tǒng)骨修復(fù)材料均有不同程度的缺點(diǎn)，其中自體骨因取骨導(dǎo)致患者創(chuàng)傷和痛苦增加，且取骨有限，難以滿足大段骨移植的要求；同種異體骨有潛在的疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，也容易出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)而導(dǎo)致并發(fā)癥；金屬假體則存在斷裂、松動(dòng)、不可降解、組織相容性差等問題[1-3]。鑒于此，骨組織工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，組織工程骨被廣泛應(yīng)用于臨床且其應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，然而目前關(guān)于組織工程骨修復(fù)骨缺損的報(bào)道存在納入臨床病例數(shù)少、隨訪時(shí)間不夠長、甚至未與傳統(tǒng)骨移植材料進(jìn)行對(duì)比等局限性，導(dǎo)致無法完全確定組織工程骨的長期臨床療效和生物安全性。因此，本研究收集2010年3月至2015年2月因四肢長骨缺損于我院行個(gè)體化組織工程骨或同種異體骨植入的62例患者的臨床資料，通過比較2種植入材料治療四肢長骨缺損的中長期臨床療效，旨在為組織工程骨的廣泛運(yùn)用提供更可靠的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本組四肢長骨缺損患者62例，其中個(gè)體化組織工程骨植入32例(觀察組)，年齡6～57歲；同種異體骨植入30例(對(duì)照組)，年齡7～58歲?；颊叩男詣e、年齡、骨缺損原因以及骨缺損部位組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：各種長骨良性骨腫瘤和瘤樣病變、骨折后骨不連、骨巨細(xì)胞瘤手術(shù)刮除所致骨缺損和創(chuàng)傷后導(dǎo)致的骨缺損；符合骨移植標(biāo)準(zhǔn)；骨移植材料為個(gè)體化組織工程骨或同種異體骨；臨床病歷資料完整；隨訪時(shí)間不少于48個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡60歲以上；伴發(fā)重要臟器功能不全、活動(dòng)性感染、其他嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病以及精神疾??；各種傳染病、惡性骨腫瘤等導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)損害；嗜酒、吸毒?；颊呒凹覍賹?duì)手術(shù)均知情同意，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 個(gè)體化組織工程骨制備

術(shù)前2周行常規(guī)檢查以初步排除抽取骨髓的禁忌證，在無菌條件下，于患者兩側(cè)髂前上嵴穿刺抽取骨髓10 mL，采用密度梯度離心法獲取有核細(xì)胞并接種到培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)，為獲得足量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone mesenchymal stem cells,hBMSCs)，需在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)、擴(kuò)增。按照美國組織庫協(xié)會(huì)制定的相關(guān)生物標(biāo)準(zhǔn)[4]，將捐獻(xiàn)的人體骨組織制備成脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix,DBM)作為組織工程骨的支架材料，根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果估算所需要的量，在患者自體血清中浸泡2～3 d，用紫外燈滅菌后保存于無菌柜中待用。對(duì)誘導(dǎo)分化后含有hBMSCs的懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為2.0×106/mL，取1 mL滴加至備用的支架材料上，使之完全浸濕，之后置于飽和濕度、5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育不少于4 h，細(xì)胞貼壁后加入適量成骨條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，使組織塊構(gòu)建完整。術(shù)前同期對(duì)構(gòu)建的組織工程骨塊進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)檢查。

表1 患者臨床資料比較(例)

1.3 手術(shù)方法

術(shù)前對(duì)患者進(jìn)行體格檢查、血液學(xué)檢查以及患肢局部檢查，進(jìn)而明確周圍組織和骨病變部位之間的關(guān)系，對(duì)病變部位的大小和體積進(jìn)行測(cè)量，核對(duì)所需植骨量。所有手術(shù)均由同一組醫(yī)護(hù)人員采用相似方案完成?；颊呔腥砺樽砘蛏窠?jīng)阻滯麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾，按骨科手術(shù)方法顯露病灶區(qū)，將骨髓腔內(nèi)的病變和硬化組織刮除干凈以確保骨髓腔開放，之后依次經(jīng)苯酚、95%乙醇滅活以及蒸餾水浸泡后注入37 ℃生理鹽水以測(cè)量囊腔內(nèi)體積并反復(fù)沖洗，盡量滅活病變組織以避免復(fù)發(fā)，之后即可植入同種異體骨或備用的組織工程骨，注意松緊適宜，保證骨組織和骨膜血液供應(yīng)，鄰近關(guān)節(jié)處則應(yīng)避免損傷關(guān)節(jié)軟骨。植骨結(jié)束后徹底止血，常規(guī)引流，檢查無誤后關(guān)閉創(chuàng)口，視病情采取合適的內(nèi)固定，必要時(shí)進(jìn)行外固定。術(shù)后行抗生素常規(guī)治療，術(shù)后48～72 h拔除引流管，術(shù)后第1天根據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行適宜的功能鍛煉，分別于術(shù)后3周和術(shù)后6周開始四肢的負(fù)重能力鍛煉，術(shù)后1年視患者骨愈合情況決定是否行內(nèi)固定取出。

1.4 療效評(píng)估

記錄患者骨愈合時(shí)間、術(shù)后1年骨愈合評(píng)分。骨愈合標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)X射線片和CT等影像學(xué)檢查無明顯未修復(fù)透光區(qū)，骨缺損區(qū)植入的骨修復(fù)材料與宿主骨的新生骨組織基本融合，骨形態(tài)恢復(fù)至正常，骨皮質(zhì)達(dá)到鄰近正常骨皮質(zhì)厚度，能進(jìn)行日?；顒?dòng)，并可避免骨折。參照Sanghani-Kerai等[5]提出的方法進(jìn)行骨愈合評(píng)分，術(shù)后1年對(duì)患者的骨缺損區(qū)行X射線片檢查以評(píng)價(jià)移植骨的愈合情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：有連續(xù)性骨小梁、與正常骨組織分界不清記3分；無定形骨形成記2分；僅有少量不連續(xù)骨小梁形成記1分；無明顯可見骨質(zhì)形成記0分。

術(shù)后1年采用Enneking肢體系統(tǒng)功能等級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)和日常生活功能評(píng)價(jià)量表(activities of daily living,ADL)評(píng)價(jià)患者術(shù)后功能恢復(fù)情況[6-7]。Enneking肢體系統(tǒng)功能等級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：上、下肢功能評(píng)分均包括肢體疼痛、功能活動(dòng)、自我感受，另外上肢功能評(píng)分還有腕關(guān)節(jié)活動(dòng)度、工作能力、精細(xì)操作，下肢功能評(píng)分還有支具使用、行走能力、步態(tài)改變；每項(xiàng)6個(gè)等級(jí)，分別對(duì)應(yīng)0～5分，滿分30分，積分除以滿分即為肢體功能所達(dá)到正常功能的百分比。ADL：評(píng)價(jià)上肢的有11項(xiàng)，評(píng)價(jià)下肢的有10項(xiàng)，如患肢能執(zhí)行所有肢體活動(dòng)即為日常功能無任何受限；若不能執(zhí)行1～3項(xiàng)日常活動(dòng)，為輕微受限；若不能執(zhí)行4～7項(xiàng)活動(dòng)，為中等受限；若無法完成8項(xiàng)及以上活動(dòng)則為嚴(yán)重受限。

1.5 安全性評(píng)估

觀察組術(shù)前同期對(duì)組織工程骨塊進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)。術(shù)前和術(shù)后1周內(nèi)，監(jiān)測(cè)患者體溫、脈搏、呼吸、血壓等基本生命體征，患肢植骨區(qū)切口愈合、局部皮膚溫度變化、周徑、血運(yùn)、感覺、神經(jīng)反射以及不良反應(yīng)。對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪，以病理檢查和影像學(xué)資料評(píng)估致瘤性以及復(fù)發(fā)情況。

1.6 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

術(shù)前和術(shù)后1周、1個(gè)月、18個(gè)月均采集患者空腹外周肘靜脈血15 mL，分別用于檢測(cè)患者血常規(guī)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)及肝腎功能；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、免疫球蛋白A(immunoglobulin,IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin,IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)；采用郭峰[8]的酵母菌花環(huán)法檢測(cè)紅細(xì)胞免疫指標(biāo):免疫黏附促進(jìn)因子(rosette forming enhancement rate,RFER)、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(red blood cell-C3bR rosette rate,RBC-C3bR)、免疫黏附抑制因子(rosette forming inhibitor rate,REIR)、免疫復(fù)合物花環(huán)率(red blood cell immune complex rate,RBC-ICR)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床療效比較

患者術(shù)后1年骨愈合評(píng)分、Enneking評(píng)分以及ADL肢體功能評(píng)價(jià)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組骨愈合時(shí)間較對(duì)照組短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 臨床療效比較

2.2 安全性比較

觀察組術(shù)前同期組織工程骨塊均無細(xì)菌和真菌生長。所有患者全身無不良反應(yīng)，切口無疼痛、紅腫、竇道及分泌物等炎癥反應(yīng)，均為Ⅰ期愈合。術(shù)后3年觀察組有1例患者因外傷導(dǎo)致左股骨骨折，行骨折復(fù)位鋼板螺釘內(nèi)固定術(shù)后愈合良好，其余患者治療效果均較好，無復(fù)發(fā)和惡變發(fā)生。對(duì)照組有4例患者出現(xiàn)術(shù)后切口分泌物增多，局部皮膚溫度高甚至肢體腫脹，采取對(duì)癥治療后切口均愈合，其余患者切口均為Ⅰ期愈合，無不良反應(yīng)發(fā)生。對(duì)照組術(shù)后有1例患者術(shù)區(qū)反復(fù)隱痛不適并伴發(fā)膝關(guān)節(jié)外翻輕度受限。

患者術(shù)前體溫、脈搏、呼吸、收縮壓、舒張壓、患肢植骨區(qū)周徑、局部皮膚溫度以及術(shù)后2 d脈搏、呼吸、收縮壓、舒張壓組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組患者術(shù)后2 d脈搏、呼吸、收縮壓、舒張壓與術(shù)前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組術(shù)后2 d患肢植骨區(qū)周徑與術(shù)前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組術(shù)后2 d患肢植骨區(qū)周徑大于觀察組及術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組患者術(shù)后2 d體溫和局部皮膚溫度均較術(shù)前升高，且對(duì)照組高于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.3 肝腎功能結(jié)果比較

患者谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)及組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)，2組患者尿酸(uric acid,UA)、肌酐(creatinine,Cr)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1周2組患者UA和Cr均較術(shù)前升高，且觀察組升高幅度小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后1～18個(gè)月雖有波動(dòng)，但與術(shù)前相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 安全性比較

表4 肝腎功能結(jié)果比較

2.4 血沉和血常規(guī)結(jié)果比較

與術(shù)前相比，2組患者術(shù)后1周ESR、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count,WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(neutrophils percentage,NEU%)以及淋巴細(xì)胞百分比(neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)均升高，且觀察組升高幅度小于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述指標(biāo)在術(shù)后1～18個(gè)月的隨訪中均逐漸恢復(fù)至正常水平，見表5。

表5 ESR和血常規(guī)結(jié)果比較

2.5 炎癥因子比較

與術(shù)前比較，2組患者術(shù)后1周CRP、IL-6及TNF-α升高，IL-4和TGF-β降低，且觀察組升高/降低幅度小于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述指標(biāo)在術(shù)后1～18個(gè)月的隨訪中均逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平，見表6。

表6 炎癥因子比較

2.6 免疫功能指標(biāo)比較

與術(shù)前相比，2組患者術(shù)后1周IgA、IgG、IgM及紅細(xì)胞免疫指標(biāo)RFER、RBC-C3bR降低，REIR、RBC-ICR升高，且觀察組降低/升高幅度小于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述指標(biāo)在術(shù)后1～18個(gè)月的隨訪中均逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平，見表7。

表7 免疫功能指標(biāo)比較

3 討論

理想的骨移植材料應(yīng)具備良好的生物相容性，可實(shí)現(xiàn)完全生物降解，局部能形成微酸性生物環(huán)境，兼具骨生成性、傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性，利于成骨細(xì)胞和血管長入等特點(diǎn)[9]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用組織工程骨修復(fù)大動(dòng)物骨缺損實(shí)驗(yàn)以及修復(fù)人類骨缺損試驗(yàn)均取得較好效果，為臨床骨缺損修復(fù)這一難題提供了新的方法[10-12]。本研究結(jié)果表明，個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨修復(fù)人四肢長骨缺損均獲得較好的中長期療效，術(shù)后1年患者骨愈合和肢體功能恢復(fù)良好，骨移植材料與周邊正常骨組織骨密度基本一致，患者肢體疼痛、活動(dòng)障礙等臨床癥狀顯著緩解，且個(gè)體化組織工程骨植入后骨愈合時(shí)間明顯縮短，說明其成骨能力更優(yōu)異。分析原因與組織工程骨的組成密切相關(guān)，首先組織工程骨使用了發(fā)揮骨傳導(dǎo)作用的支架材料，其次其含有促進(jìn)骨誘導(dǎo)、新骨生成以及血管化的生長因子，最重要的是組織工程骨存在具有較高成骨分化潛能的種子細(xì)胞，即自體BMSCs，可為組織工程骨提供大量的活性成分。該結(jié)果與以往國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的BMSCs對(duì)骨缺損修復(fù)具有促進(jìn)作用，以及含有BMSCs的組織工程骨可提高骨缺損的修復(fù)效果一致[13-14]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)60歲以上的患者BMSCs的增殖分化能力和成骨活性較低，無法滿足作為種子細(xì)胞的要求[15]，因此本研究僅納入了60歲以下由多種原因造成的四肢長骨缺損的患者。

雖然個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨修復(fù)骨缺損效果較好，但其近中長期的安全性仍是最值得關(guān)注的問題。本研究結(jié)果表明，植入個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨近中長期安全均有保障，但總體來看，個(gè)體化組織工程骨安全性更高。本研究對(duì)2組患者術(shù)后連續(xù)1周進(jìn)行安全性評(píng)估，但患者體溫和局部皮膚溫度僅在術(shù)后2 d時(shí)明顯升高，且對(duì)照組高于觀察組，另外術(shù)后2 d時(shí)對(duì)照組患肢植骨區(qū)周徑明顯大于術(shù)前和觀察組，分析原因與對(duì)照組有4例患者出現(xiàn)術(shù)后切口分泌物增多、局部皮膚溫度高甚至肢體腫脹有關(guān)。手術(shù)創(chuàng)傷本身就是一種應(yīng)激源，術(shù)后短期內(nèi)患者體溫升高屬正常生理病理反應(yīng)，隨著傷口愈合即可恢復(fù)正常；同種異體骨可能由于存在一定的免疫排斥反應(yīng)而導(dǎo)致體溫更高，患肢發(fā)生腫脹而使植骨區(qū)周徑變大。作為臨床上常使用的監(jiān)測(cè)肝功能的指標(biāo)，血液中ALT和AST活性能敏感地反映肝組織是否發(fā)生損傷以及損傷程度[16]。UA和Cr則常被用于反映腎受損情況和腎功能[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡段的人群ALP水平差異較大[18]。本研究2組患者中兒童和成年人比例相當(dāng)，因此未對(duì)不同年齡人群進(jìn)行分組比較。本研究中，患者ALT、AST及ALP活性在組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)和組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2組患者UA和Cr僅在術(shù)后1周顯著升高，且升高后水平仍在正常參考范圍內(nèi)。說明個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨均無肝腎毒性，與早期文獻(xiàn)報(bào)道相符[19]。

ESR和血常規(guī)是臨床常規(guī)檢查項(xiàng)目，WBC、NEU%以及NLR是血常規(guī)的檢查指標(biāo)[20]。臨床上，CRP常被用作感染、組織損傷以及炎癥反應(yīng)的敏感性標(biāo)志物[21]；IL-6和TNF-α為常見的促炎因子，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體組織的炎癥反應(yīng)，常被用于反映組織和器官的損傷程度[22]；IL-4和TGF-β則是常見的抗炎因子，參與抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，對(duì)免疫抑制發(fā)揮控制作用，從而拮抗炎癥反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果表明個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨植入后患者均在術(shù)后1周出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，且觀察組患者炎癥反應(yīng)更輕微，推測(cè)是由手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)，對(duì)照組患者炎癥反應(yīng)較重可能與其具有一定程度的免疫排斥反應(yīng)相關(guān)，術(shù)后1個(gè)月復(fù)查及更長期隨訪結(jié)果顯示炎癥反應(yīng)均消失，證實(shí)個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨植入中長期安全性可靠，與Kawecki等[24]的結(jié)論一致。IgA、IgG、IgM可作為評(píng)估機(jī)體免疫功能以及移植骨是否存在排斥反應(yīng)的檢驗(yàn)指標(biāo)。近年來有研究顯示，紅細(xì)胞免疫與感染、機(jī)體炎癥反應(yīng)以及預(yù)后關(guān)系密切，能有效反映機(jī)體免疫狀況[25]。本研究中，2組患者僅在術(shù)后1周免疫功能降低，且觀察組患者免疫狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組，這與個(gè)體化組織工程骨無免疫源性，不會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)密切相關(guān)。術(shù)后1～18個(gè)月隨訪中上述指標(biāo)均逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平，同樣證實(shí)個(gè)體化組織工程骨和同種異體骨植入安全性高的特點(diǎn)。

綜上，個(gè)體化組織工程骨修復(fù)人長骨缺損比同種異體骨成骨能力更優(yōu)異，骨愈合時(shí)間明顯較短，其近中長期的生物安全性更可靠，值得臨床上推廣使用。