錢 進(jìn)，龔子臣，張義娜，鄭 偉，康 夏 (西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，四川 成都 610000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種可發(fā)生于全身各個關(guān)節(jié)的進(jìn)行性退化性疾病，高發(fā)于老年人。據(jù)統(tǒng)計(jì)，65歲以上老年人中影像學(xué)檢查有骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)的比例高達(dá)60%，80歲以上老年人有骨關(guān)節(jié)炎的比例高達(dá)80%[1]，且骨關(guān)節(jié)炎具有不可逆轉(zhuǎn)性和高致殘性等特點(diǎn)，因此在老齡化加劇的時代會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎主要是以滑膜炎癥、軟骨退化為特征的病變。近年來滑膜病變在骨關(guān)節(jié)炎中的致病作用日益受到重視，成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibro-like synoviocyte,FLS)是關(guān)節(jié)滑膜的主要細(xì)胞成分，其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中會出現(xiàn)增殖以及細(xì)胞因子表達(dá)譜改變等特征，導(dǎo)致纖維化程度加重、軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨退化等病變，加重疾病進(jìn)展，但目前尚不清楚骨關(guān)節(jié)炎環(huán)境下FLS增殖的調(diào)控機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，在增殖活躍的FLS中MDM4表達(dá)增高，但其是否調(diào)控了FLS的增殖尚待進(jìn)一步研究[2-3]。另一方面，microRNA-144(mir-144)廣泛參與各種細(xì)胞的增殖[4-6]，也調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的凋亡[7]，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MDM4可能是mir-144的靶基因。因此，本研究假設(shè)mir-144可能通過調(diào)控MDM4的表達(dá)影響FLS的增殖，探討mir-144與MDM4之間的調(diào)控關(guān)系以及兩者在炎癥環(huán)境下對FLS和軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

從C57BL/6小鼠中直接提取原代FLS和軟骨細(xì)胞，agomir-144、agomir陰性對照(negative control,NC)、antagomir-144、antagomir NC、mir-144 mimics及其陰性對照、MDM4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉馬公司設(shè)計(jì)并合成。DMEM培養(yǎng)基(BI公司，貨號：01-052-1ACS)，胎牛血清(BI公司，貨號：04-001-1A)，INVI DNA RNA Transfection Reagent (Invigentech，貨號：IV1216150)，TRIzol裂解液(Invitrogen，貨號：15596026)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific，貨號：K1622)，SYBR Green PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific，貨號：4309155)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega，貨號：N1610)，CCK-8試劑盒(日本同仁，貨號：CA1210-100)，MDM4抗體(Abcam，貨號：ab49993)，GAPDH抗體(CST，貨號：5174)，Hoechst 33342(碧云天，貨號：C1029)，IL-1β(Biolegend，貨號：575102)，BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Biolegend，貨號：14246)，Tunel凋亡檢測試劑盒(羅氏，貨號：12156792910)。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞提取 將10～12周的C57BL/6小鼠滑膜組織取下后剪碎，放入0.1%的Ⅳ型膠原酶中，在37 ℃搖床中消化60 min。然后在振蕩器上震蕩90 s，將組織懸液以300 g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的細(xì)胞分為IL-1β刺激組和對照組。在體外模擬骨關(guān)節(jié)炎環(huán)境中，IL-1β刺激組培養(yǎng)基中加入IL-1β(5 ng/mL)刺激12 h，對照組加入PBS，然后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將原代細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，融合度達(dá)到70%～80%后，按照INVI DNA RNA Transfection Reagent說明書將agomir-144、agomir NC、antagomir-144、antagomir NC和MDM4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至FLS中，或?qū)ir-144 mimics和MDM4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中。在抑制MDM4表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，用相同方法轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA或其對照siRNA(scRNA)至原代FLS中。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測 收集對數(shù)期生長的293細(xì)胞，鋪于96孔板，每孔約5 000個細(xì)胞，約24 h細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染mimics NC+MDM4 Wt、mir-144 mimics+MDM4 Wt、MDM4 Wt或mimics NC+MDM4 Mut、mir-144 mimics+MDM4 Mut、MDM4 Mut，按照雙熒光素酶報(bào)告試劑盒說明檢測細(xì)胞裂解液中螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 用TRIzol試劑提取總RNA，然后按照說明書方法使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時熒光定量PCR按照SYBR Green試劑說明書方法進(jìn)行。mir-144的內(nèi)參為U6，其余目標(biāo)mRNA的內(nèi)參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白印跡檢測 用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，SDS-PAGE膠以80 V恒壓處理2 h分離蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法以80 V恒壓處理90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA封閉1 h，加入一抗MDM4(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)4 ℃過夜，然后洗去多余一抗，加入二抗山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后用ECL顯影劑曝光。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光組化 將處理后的細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗去甲醛后加入0.5% Triton X-100處理10 min，然后PBS漂洗，滴加含10%驢血清的5%BSA封閉液，在37 ℃下封閉1 h，孵育一抗MDM4(1∶100)；然后洗去多余一抗，室溫避光孵育二抗驢抗小鼠Alexa Flour 647(1∶200)，洗去多余二抗，滴加Hoechst 33342(1∶1 000)，室溫避光孵育15 min，洗去多余Hoechst 33342。

1.2.7 細(xì)胞增殖檢測 BrdU檢測法：在檢測MDM4對細(xì)胞增殖的影響時，分別在IL-1β刺激組和對照組中轉(zhuǎn)染scRNA或MDM4-siRNA；而在檢測MDM4對miRNA-144介導(dǎo)細(xì)胞增殖的影響時，分為agomir NC組、agomir NC+MDM4過表達(dá)質(zhì)粒組、agomir-144組及agomir-144+MDM4過表達(dá)質(zhì)粒組，其中未轉(zhuǎn)染MDM4過表達(dá)質(zhì)粒時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照。在收樣前2 h加入BrdU溶液(0.5 μL/mL)繼續(xù)孵育。然后將處理后的細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，離心棄上清，按照Phase-Flow BrdU檢測試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)步驟，最后通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測BrdU陽性細(xì)胞比例。CCK-8法：分別轉(zhuǎn)染scRNA(scRNA-NC組)，轉(zhuǎn)染scRNA后用IL-1β刺激(scRNA-IL1β組)，轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA(siMDM4-NC組)以及轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA后用IL-1β刺激(siMDM4-IL1β組)，其中沒有用IL-1β刺激的組用等量PBS替代。將處理后的細(xì)胞更換為100 μL培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，孵育2 h后通過分光光度儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測 Tunel法：將處理后的細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，離心棄上清，按照羅氏Tunel凋亡檢測試劑盒說明書步驟處理細(xì)胞，最后通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測Tunel陽性細(xì)胞比例。

1.2.9 間接共培養(yǎng)檢測 按照前述方法將轉(zhuǎn)染后的FLS培養(yǎng)48 h，棄上清，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集培養(yǎng)基，按照1∶1比例加入到培養(yǎng)軟骨原代細(xì)胞的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后收樣。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 炎癥環(huán)境促進(jìn)MDM4在FLS的中表達(dá)

通過IL-1β刺激原代FLS模擬炎癥環(huán)境，然后檢測IL-1β刺激組與對照組中MDM4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，IL-1β顯著促進(jìn)細(xì)胞核中MDM4的蛋白表達(dá)(圖1a)，平均熒光強(qiáng)度明顯增高(圖1b)。收集2組細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，IL-1β制激組中MDM4蛋白表達(dá)量上調(diào)(圖1c、d)。

a：細(xì)胞免疫熒光組化法檢測MDM4在FLS中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位；b：MDM4熒光表達(dá)強(qiáng)度的定量分析；c：蛋白印跡檢測MDM4的蛋白表達(dá)水平；d：MDM4和GAPDH蛋白表達(dá)灰度值比值 #：P<0.01

2.2 MDM4促進(jìn)FLS在炎癥環(huán)境中的增殖

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，IL-1β處理后BrdU陽性FLS比例顯著升高。在IL-1β刺激組中，用siRNA干預(yù)MDM4表達(dá)后，BrdU陽性FLS比例顯著降低；而在對照組中，用siRNA干預(yù)MDM4后，BrdU陽性FLS比例無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖2a、b。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，IL-1β刺激后可顯著提高FLS的增殖能力，而使用siRNA抑制MDM4表達(dá)后FLS的增殖能力顯著下降，與siMDM4-NC組水平相當(dāng)。同時siRNA處理后并不能影響scRNA-NC組中FLS的增殖(圖2c)。

a：流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同刺激情況下BrdU陽性FLS比例；b：BrdU陽性FLS比例的定量分析；c：CCK-8法檢測不同刺激條件下各時間點(diǎn)FLS的吸光度值 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

2.3 MDM4是mir-144的靶基因

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，IL-1β顯著降低mir-144的表達(dá)水平(圖3a)。生物信息學(xué)分析(TargetScan.org)顯示，MDM4 3’UTR端與mir-144存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3b)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測顯示，mimic mir-144明顯抑制了含有MDM4 Wt序列質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖3c)；而對含有MDM4 Mut序列質(zhì)粒的熒光素酶活性無顯著影響(圖3d)。蛋白印跡檢測顯示，mir-144過表達(dá)會抑制FLS中MDM4蛋白的表達(dá)，而抑制mir-144后，MDM4蛋白表達(dá)升高(圖3e、f)。

2.4 mir-144通過調(diào)控MDM4的表達(dá)影響FLS的增殖

為進(jìn)一步驗(yàn)證mir-144通過MDM4調(diào)控FLS在炎癥環(huán)境中的增殖，本研究轉(zhuǎn)染了agomir-144及MDM4過表達(dá)質(zhì)粒，然后用IL-1β刺激體外模擬炎癥環(huán)境。BrdU增殖檢測提示，agomir-144能顯著抑制FLS的增殖；過表達(dá)MDM4可以促進(jìn)FLS的增殖，同時能夠逆轉(zhuǎn)agomir-144對FLS增殖的抑制作用(圖4a、b)。增殖標(biāo)志物Cyclin D1和CKD2的mRNA表達(dá)水平增高，與BrdU結(jié)果吻合(圖4c、d)。

2.5 mir-144抑制FLS介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,mir-144過表達(dá)組中MMP-9、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平均降低(圖5a～c)。通過用FLS的培養(yǎng)基刺激軟骨細(xì)胞，Tunel凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，mir-144過表達(dá)組培養(yǎng)基處理的軟骨細(xì)胞凋亡顯著下降，而mir-144抑制組培養(yǎng)基處理的軟骨細(xì)胞凋亡顯著增高(圖5d、e)。

a：實(shí)時熒光定量PCR檢測FLS中mir-144的RNA表達(dá)水平；b：MDM4 3’UTR端和mir-144的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)；c、d：雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測mir-144與Wt、Mut MDM4 3’UTR端的熒光強(qiáng)度比值；e：蛋白印跡檢測MDM4的蛋白表達(dá)水平；f：MDM4和GAPDH蛋白表達(dá)灰度值比值 *：P<0.05；#：P<0.01

a：流式細(xì)胞技術(shù)檢測IL-1β刺激下mir-144干預(yù)以及過表達(dá)MDM4情況下BrdU陽性FLS比例；b：各組BrdU陽性FLS比例的定量分析；c、d：實(shí)時熒光定量PCR檢測IL-1β處理的FLS中Cyclin D1、CKD2的mRNA表達(dá)水平 *：P<0.05；#：P<0.01

a、b、c：IL-1β處理后FLS細(xì)胞中MMP-9、TNA-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平；d：流式細(xì)胞術(shù)檢測在不同組的FLS條件培養(yǎng)基刺激下，軟骨細(xì)胞中Tunel陽性的細(xì)胞比例；e：對(d)的定量分析 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

3 討論

滑膜病變對骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展具有重要的調(diào)控作用，骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中會出現(xiàn)巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞浸潤，IL-17、TNF-α等炎癥因子表達(dá)也明顯增高[8-13]。在這些炎癥細(xì)胞和炎癥因子的刺激下，F(xiàn)LS會出現(xiàn)增殖、侵襲性增強(qiáng)等變化，并釋放多種炎癥因子及金屬基質(zhì)蛋白酶，導(dǎo)致軟骨破壞、軟骨細(xì)胞凋亡等，最終加重骨關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展[11]。IL-1β是體外模擬關(guān)節(jié)炎環(huán)境的經(jīng)典炎癥因子[12]。本研究使用IL-1β刺激FLS后，其增殖能力明顯增強(qiáng)，提示炎癥環(huán)境能夠促進(jìn)FLS的增殖，這與上述研究結(jié)果相符。

目前研究發(fā)現(xiàn)FLS的增殖受多條通路的調(diào)控，Wnt/β-catenin通路、NF-kappaB通路、SPRY1等均參與其中[14-16]。MDM4是一個原癌基因，能夠抑制P53蛋白的抑癌作用，其在多種腫瘤中高表達(dá)[17]。MDM4高表達(dá)與多種細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[18-21]。研究表明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中，MDM4的表達(dá)與FLS的增殖呈正相關(guān)，但是MDM4是否調(diào)控FLS的增殖及其在骨關(guān)節(jié)炎中的作用尚待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)體外炎癥環(huán)境下FLS細(xì)胞核中的MDM4蛋白表達(dá)水平顯著增高，抑制MDM4的表達(dá)后，F(xiàn)LS的增殖明顯降低；而在非炎癥環(huán)境中，抑制MDM4后FLS的增殖能力無明顯改變，說明MDM4主要是在炎癥環(huán)境中調(diào)控FLS的增殖，而在正常環(huán)境中對其增殖無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)MDM4在正常FLS中的表達(dá)水平偏低，因此認(rèn)為MDM4對正常環(huán)境中FLS的增殖調(diào)控作用不明顯，這可能是因?yàn)槠涞鞍妆磉_(dá)未被激活。這一發(fā)現(xiàn)證明MDM4特異性調(diào)控炎癥環(huán)境中的FLS，并對FLS的細(xì)胞學(xué)行為具有重要的影響。

有研究表明，microRNA對FLS及MDM4均有重要的調(diào)控作用，mir-155、mir-495、mir-101-3p等均可調(diào)控FLS的增殖和炎癥因子的釋放[22-24]。另一方面，mir-661可以通過下調(diào)MDM4的表達(dá)而激活P53，mir-1307可以通過調(diào)控MDM4介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥，mir-128可以通過抑制MDM4的表達(dá)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡[25-27]。這些研究均提示microRNA是參與滑膜炎癥和MDM4表達(dá)的重要調(diào)控因子。此外，mir-144可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展。本研究也發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境中mir-144在FLS中的表達(dá)下降，結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MDM4是mir-144的靶基因之一；不僅如此，與MDM4的siRNA作用類似，mir-144也可以通過調(diào)控MDM4的表達(dá)抑制FLS在炎癥環(huán)境中的增殖，說明mir-144是FLS在炎癥環(huán)境中的一個關(guān)鍵的調(diào)控因素，MDM4是其重要靶點(diǎn)之一，兩者對FLS的增殖均起到了重要的調(diào)控作用。

由于MDM4可促進(jìn)多種金屬基質(zhì)蛋白酶的釋放，而mir-144調(diào)控了MMP-9、TNF-α和IL-6等多種炎癥因子的表達(dá)[28-31]，這些因子可直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡并破壞軟骨。因此本研究進(jìn)一步檢測了mir-144是否影響這些因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-144過表達(dá)后，F(xiàn)LS中與軟骨破壞密切相關(guān)的因子(MMP-9、TNF-α和IL-6)水平均明顯下降，而軟骨細(xì)胞凋亡亦受到抑制，提示mir-144能夠改變FLS的表達(dá)譜，進(jìn)而改善軟骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MDM4是mir-144的靶基因，兩者的相互平衡對FLS的增殖及表達(dá)譜具有重要的調(diào)控作用，且mir-144能夠通過抑制FLS的增殖和降低軟骨破壞相關(guān)因子的表達(dá)改善軟骨細(xì)胞的凋亡，mir-144和MDM4可能成為骨關(guān)節(jié)炎治療的新靶點(diǎn)，在動物體內(nèi)和人標(biāo)本中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證有助于深入了解mir-144通過調(diào)控MDM4在骨關(guān)節(jié)炎FLS細(xì)胞學(xué)行為中的意義及潛在的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。