錢 進，龔子臣，張義娜，鄭 偉，康 夏 (西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，四川 成都 610000)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種可發(fā)生于全身各個關節(jié)的進行性退化性疾病，高發(fā)于老年人。據(jù)統(tǒng)計，65歲以上老年人中影像學檢查有骨關節(jié)炎表現(xiàn)的比例高達60%，80歲以上老年人有骨關節(jié)炎的比例高達80%[1]，且骨關節(jié)炎具有不可逆轉(zhuǎn)性和高致殘性等特點，因此在老齡化加劇的時代會帶來沉重的經(jīng)濟負擔和社會負擔。骨關節(jié)炎主要是以滑膜炎癥、軟骨退化為特征的病變。近年來滑膜病變在骨關節(jié)炎中的致病作用日益受到重視，成纖維樣滑膜細胞(fibro-like synoviocyte,FLS)是關節(jié)滑膜的主要細胞成分，其在骨關節(jié)炎發(fā)病過程中會出現(xiàn)增殖以及細胞因子表達譜改變等特征，導致纖維化程度加重、軟骨細胞凋亡、軟骨退化等病變，加重疾病進展，但目前尚不清楚骨關節(jié)炎環(huán)境下FLS增殖的調(diào)控機制。既往研究發(fā)現(xiàn)，在增殖活躍的FLS中MDM4表達增高，但其是否調(diào)控了FLS的增殖尚待進一步研究[2-3]。另一方面，microRNA-144(mir-144)廣泛參與各種細胞的增殖[4-6]，也調(diào)控骨關節(jié)炎中軟骨細胞的凋亡[7]，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)MDM4可能是mir-144的靶基因。因此，本研究假設mir-144可能通過調(diào)控MDM4的表達影響FLS的增殖，探討mir-144與MDM4之間的調(diào)控關系以及兩者在炎癥環(huán)境下對FLS和軟骨細胞的調(diào)控作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

從C57BL/6小鼠中直接提取原代FLS和軟骨細胞，agomir-144、agomir陰性對照(negative control,NC)、antagomir-144、antagomir NC、mir-144 mimics及其陰性對照、MDM4熒光素酶報告質(zhì)粒及過表達質(zhì)粒由上海吉馬公司設計并合成。DMEM培養(yǎng)基(BI公司，貨號：01-052-1ACS)，胎牛血清(BI公司，貨號：04-001-1A)，INVI DNA RNA Transfection Reagent (Invigentech，貨號：IV1216150)，TRIzol裂解液(Invitrogen，貨號：15596026)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific，貨號：K1622)，SYBR Green PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific，貨號：4309155)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega，貨號：N1610)，CCK-8試劑盒(日本同仁，貨號：CA1210-100)，MDM4抗體(Abcam，貨號：ab49993)，GAPDH抗體(CST，貨號：5174)，Hoechst 33342(碧云天，貨號：C1029)，IL-1β(Biolegend，貨號：575102)，BrdU細胞增殖檢測試劑盒(Biolegend，貨號：14246)，Tunel凋亡檢測試劑盒(羅氏，貨號：12156792910)。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞提取 將10～12周的C57BL/6小鼠滑膜組織取下后剪碎，放入0.1%的Ⅳ型膠原酶中，在37 ℃搖床中消化60 min。然后在振蕩器上震蕩90 s，將組織懸液以300 g離心5 min，棄上清，將細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的細胞分為IL-1β刺激組和對照組。在體外模擬骨關節(jié)炎環(huán)境中，IL-1β刺激組培養(yǎng)基中加入IL-1β(5 ng/mL)刺激12 h，對照組加入PBS，然后收集細胞進行后續(xù)檢測。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將原代細胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，融合度達到70%～80%后，按照INVI DNA RNA Transfection Reagent說明書將agomir-144、agomir NC、antagomir-144、antagomir NC和MDM4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至FLS中，或?qū)ir-144 mimics和MDM4熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細胞中。在抑制MDM4表達的實驗中，用相同方法轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA或其對照siRNA(scRNA)至原代FLS中。

1.2.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測 收集對數(shù)期生長的293細胞，鋪于96孔板，每孔約5 000個細胞，約24 h細胞貼壁后，轉(zhuǎn)染mimics NC+MDM4 Wt、mir-144 mimics+MDM4 Wt、MDM4 Wt或mimics NC+MDM4 Mut、mir-144 mimics+MDM4 Mut、MDM4 Mut，按照雙熒光素酶報告試劑盒說明檢測細胞裂解液中螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值。

1.2.4 實時熒光定量PCR 用TRIzol試劑提取總RNA，然后按照說明書方法使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR按照SYBR Green試劑說明書方法進行。mir-144的內(nèi)參為U6，其余目標mRNA的內(nèi)參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白印跡檢測 用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，SDS-PAGE膠以80 V恒壓處理2 h分離蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法以80 V恒壓處理90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA封閉1 h，加入一抗MDM4(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)4 ℃過夜，然后洗去多余一抗，加入二抗山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后用ECL顯影劑曝光。

1.2.6 細胞免疫熒光組化 將處理后的細胞用4 ℃預冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗去甲醛后加入0.5% Triton X-100處理10 min，然后PBS漂洗，滴加含10%驢血清的5%BSA封閉液，在37 ℃下封閉1 h，孵育一抗MDM4(1∶100)；然后洗去多余一抗，室溫避光孵育二抗驢抗小鼠Alexa Flour 647(1∶200)，洗去多余二抗，滴加Hoechst 33342(1∶1 000)，室溫避光孵育15 min，洗去多余Hoechst 33342。

1.2.7 細胞增殖檢測 BrdU檢測法：在檢測MDM4對細胞增殖的影響時，分別在IL-1β刺激組和對照組中轉(zhuǎn)染scRNA或MDM4-siRNA；而在檢測MDM4對miRNA-144介導細胞增殖的影響時，分為agomir NC組、agomir NC+MDM4過表達質(zhì)粒組、agomir-144組及agomir-144+MDM4過表達質(zhì)粒組，其中未轉(zhuǎn)染MDM4過表達質(zhì)粒時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照。在收樣前2 h加入BrdU溶液(0.5 μL/mL)繼續(xù)孵育。然后將處理后的細胞用細胞刮刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，離心棄上清，按照Phase-Flow BrdU檢測試劑盒說明書進行后續(xù)步驟，最后通過流式細胞技術檢測BrdU陽性細胞比例。CCK-8法：分別轉(zhuǎn)染scRNA(scRNA-NC組)，轉(zhuǎn)染scRNA后用IL-1β刺激(scRNA-IL1β組)，轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA(siMDM4-NC組)以及轉(zhuǎn)染MDM4-siRNA后用IL-1β刺激(siMDM4-IL1β組)，其中沒有用IL-1β刺激的組用等量PBS替代。將處理后的細胞更換為100 μL培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，孵育2 h后通過分光光度儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.2.8 細胞凋亡檢測 Tunel法：將處理后的細胞用細胞刮刮下后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，離心棄上清，按照羅氏Tunel凋亡檢測試劑盒說明書步驟處理細胞，最后通過流式細胞技術檢測Tunel陽性細胞比例。

1.2.9 間接共培養(yǎng)檢測 按照前述方法將轉(zhuǎn)染后的FLS培養(yǎng)48 h，棄上清，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集培養(yǎng)基，按照1∶1比例加入到培養(yǎng)軟骨原代細胞的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后收樣。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 炎癥環(huán)境促進MDM4在FLS的中表達

通過IL-1β刺激原代FLS模擬炎癥環(huán)境，然后檢測IL-1β刺激組與對照組中MDM4的表達情況，結(jié)果顯示，IL-1β顯著促進細胞核中MDM4的蛋白表達(圖1a)，平均熒光強度明顯增高(圖1b)。收集2組細胞進行蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，IL-1β制激組中MDM4蛋白表達量上調(diào)(圖1c、d)。

a：細胞免疫熒光組化法檢測MDM4在FLS中的表達及細胞內(nèi)定位；b：MDM4熒光表達強度的定量分析；c：蛋白印跡檢測MDM4的蛋白表達水平；d：MDM4和GAPDH蛋白表達灰度值比值 #：P<0.01

2.2 MDM4促進FLS在炎癥環(huán)境中的增殖

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，IL-1β處理后BrdU陽性FLS比例顯著升高。在IL-1β刺激組中，用siRNA干預MDM4表達后，BrdU陽性FLS比例顯著降低；而在對照組中，用siRNA干預MDM4后，BrdU陽性FLS比例無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05),見圖2a、b。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，IL-1β刺激后可顯著提高FLS的增殖能力，而使用siRNA抑制MDM4表達后FLS的增殖能力顯著下降，與siMDM4-NC組水平相當。同時siRNA處理后并不能影響scRNA-NC組中FLS的增殖(圖2c)。

a：流式細胞技術檢測不同刺激情況下BrdU陽性FLS比例；b：BrdU陽性FLS比例的定量分析；c：CCK-8法檢測不同刺激條件下各時間點FLS的吸光度值 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

2.3 MDM4是mir-144的靶基因

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，IL-1β顯著降低mir-144的表達水平(圖3a)。生物信息學分析(TargetScan.org)顯示，MDM4 3’UTR端與mir-144存在結(jié)合位點(圖3b)。進一步通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示，mimic mir-144明顯抑制了含有MDM4 Wt序列質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖3c)；而對含有MDM4 Mut序列質(zhì)粒的熒光素酶活性無顯著影響(圖3d)。蛋白印跡檢測顯示，mir-144過表達會抑制FLS中MDM4蛋白的表達，而抑制mir-144后，MDM4蛋白表達升高(圖3e、f)。

2.4 mir-144通過調(diào)控MDM4的表達影響FLS的增殖

為進一步驗證mir-144通過MDM4調(diào)控FLS在炎癥環(huán)境中的增殖，本研究轉(zhuǎn)染了agomir-144及MDM4過表達質(zhì)粒，然后用IL-1β刺激體外模擬炎癥環(huán)境。BrdU增殖檢測提示，agomir-144能顯著抑制FLS的增殖；過表達MDM4可以促進FLS的增殖，同時能夠逆轉(zhuǎn)agomir-144對FLS增殖的抑制作用(圖4a、b)。增殖標志物Cyclin D1和CKD2的mRNA表達水平增高，與BrdU結(jié)果吻合(圖4c、d)。

2.5 mir-144抑制FLS介導的軟骨細胞凋亡

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,mir-144過表達組中MMP-9、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平均降低(圖5a～c)。通過用FLS的培養(yǎng)基刺激軟骨細胞，Tunel凋亡實驗顯示，mir-144過表達組培養(yǎng)基處理的軟骨細胞凋亡顯著下降，而mir-144抑制組培養(yǎng)基處理的軟骨細胞凋亡顯著增高(圖5d、e)。

a：實時熒光定量PCR檢測FLS中mir-144的RNA表達水平；b：MDM4 3’UTR端和mir-144的預測結(jié)合位點；c、d：雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測mir-144與Wt、Mut MDM4 3’UTR端的熒光強度比值；e：蛋白印跡檢測MDM4的蛋白表達水平；f：MDM4和GAPDH蛋白表達灰度值比值 *：P<0.05；#：P<0.01

a：流式細胞技術檢測IL-1β刺激下mir-144干預以及過表達MDM4情況下BrdU陽性FLS比例；b：各組BrdU陽性FLS比例的定量分析；c、d：實時熒光定量PCR檢測IL-1β處理的FLS中Cyclin D1、CKD2的mRNA表達水平 *：P<0.05；#：P<0.01

a、b、c：IL-1β處理后FLS細胞中MMP-9、TNA-α、IL-6的mRNA表達水平；d：流式細胞術檢測在不同組的FLS條件培養(yǎng)基刺激下，軟骨細胞中Tunel陽性的細胞比例；e：對(d)的定量分析 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

3 討論

滑膜病變對骨關節(jié)炎及類風濕關節(jié)炎的病情進展具有重要的調(diào)控作用，骨關節(jié)炎患者的滑膜中會出現(xiàn)巨噬細胞、輔助性T細胞等多種炎癥細胞浸潤，IL-17、TNF-α等炎癥因子表達也明顯增高[8-13]。在這些炎癥細胞和炎癥因子的刺激下，F(xiàn)LS會出現(xiàn)增殖、侵襲性增強等變化，并釋放多種炎癥因子及金屬基質(zhì)蛋白酶，導致軟骨破壞、軟骨細胞凋亡等，最終加重骨關節(jié)炎的病情進展[11]。IL-1β是體外模擬關節(jié)炎環(huán)境的經(jīng)典炎癥因子[12]。本研究使用IL-1β刺激FLS后，其增殖能力明顯增強，提示炎癥環(huán)境能夠促進FLS的增殖，這與上述研究結(jié)果相符。

目前研究發(fā)現(xiàn)FLS的增殖受多條通路的調(diào)控，Wnt/β-catenin通路、NF-kappaB通路、SPRY1等均參與其中[14-16]。MDM4是一個原癌基因，能夠抑制P53蛋白的抑癌作用，其在多種腫瘤中高表達[17]。MDM4高表達與多種細胞的增殖密切相關[18-21]。研究表明在類風濕關節(jié)炎患者的滑膜組織中，MDM4的表達與FLS的增殖呈正相關，但是MDM4是否調(diào)控FLS的增殖及其在骨關節(jié)炎中的作用尚待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)體外炎癥環(huán)境下FLS細胞核中的MDM4蛋白表達水平顯著增高，抑制MDM4的表達后，F(xiàn)LS的增殖明顯降低；而在非炎癥環(huán)境中，抑制MDM4后FLS的增殖能力無明顯改變，說明MDM4主要是在炎癥環(huán)境中調(diào)控FLS的增殖，而在正常環(huán)境中對其增殖無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)MDM4在正常FLS中的表達水平偏低，因此認為MDM4對正常環(huán)境中FLS的增殖調(diào)控作用不明顯，這可能是因為其蛋白表達未被激活。這一發(fā)現(xiàn)證明MDM4特異性調(diào)控炎癥環(huán)境中的FLS，并對FLS的細胞學行為具有重要的影響。

有研究表明，microRNA對FLS及MDM4均有重要的調(diào)控作用，mir-155、mir-495、mir-101-3p等均可調(diào)控FLS的增殖和炎癥因子的釋放[22-24]。另一方面，mir-661可以通過下調(diào)MDM4的表達而激活P53，mir-1307可以通過調(diào)控MDM4介導乳腺癌細胞的順鉑耐藥，mir-128可以通過抑制MDM4的表達誘導胰腺癌細胞的凋亡[25-27]。這些研究均提示microRNA是參與滑膜炎癥和MDM4表達的重要調(diào)控因子。此外，mir-144可通過調(diào)控巨噬細胞影響類風濕關節(jié)炎的病情進展。本研究也發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境中mir-144在FLS中的表達下降，結(jié)合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，MDM4是mir-144的靶基因之一；不僅如此，與MDM4的siRNA作用類似，mir-144也可以通過調(diào)控MDM4的表達抑制FLS在炎癥環(huán)境中的增殖，說明mir-144是FLS在炎癥環(huán)境中的一個關鍵的調(diào)控因素，MDM4是其重要靶點之一，兩者對FLS的增殖均起到了重要的調(diào)控作用。

由于MDM4可促進多種金屬基質(zhì)蛋白酶的釋放，而mir-144調(diào)控了MMP-9、TNF-α和IL-6等多種炎癥因子的表達[28-31]，這些因子可直接誘導軟骨細胞凋亡并破壞軟骨。因此本研究進一步檢測了mir-144是否影響這些因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-144過表達后，F(xiàn)LS中與軟骨破壞密切相關的因子(MMP-9、TNF-α和IL-6)水平均明顯下降，而軟骨細胞凋亡亦受到抑制，提示mir-144能夠改變FLS的表達譜，進而改善軟骨細胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MDM4是mir-144的靶基因，兩者的相互平衡對FLS的增殖及表達譜具有重要的調(diào)控作用，且mir-144能夠通過抑制FLS的增殖和降低軟骨破壞相關因子的表達改善軟骨細胞的凋亡，mir-144和MDM4可能成為骨關節(jié)炎治療的新靶點，在動物體內(nèi)和人標本中進一步進行驗證有助于深入了解mir-144通過調(diào)控MDM4在骨關節(jié)炎FLS細胞學行為中的意義及潛在的臨床轉(zhuǎn)化應用價值。