高雪原，齊廣瑩，蘇如葵，劉家麒，鄭東妮，廖作威③

(1.北海市人民醫(yī)院普通外科二區(qū)，廣西 北海 536000；2. 桂林醫(yī)學(xué)院廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調(diào)控重點實驗室，廣西 桂林 541199)

在全球范圍內(nèi)，大腸癌(Colorectal Carcinoma， CRC)作為一種常見的消化道惡性腫瘤，一直以來嚴(yán)重地威脅著全人類的健康。近年來，中國的大腸癌新發(fā)病例和死亡病例已分別超過了27萬和13萬[1]。目前我國大多數(shù)大腸癌患者確診時已系進展期，因而，急需我們?nèi)ヌ剿餍碌哪[瘤靶點，為大腸癌的診斷治療和預(yù)后評估帶來新的方向和希望。

泛素特異性蛋白酶7(Ubiquitin Specific Protease 7， USP7)是去泛素化酶龐大家族中的一員，最初是在研究單純皰疹病毒ICP0蛋白時發(fā)現(xiàn)的，近年研究發(fā)現(xiàn)USP7與人體內(nèi)的癌基因、抑癌基因以及致瘤病毒的相關(guān)基因均有相互作用，影響了惡性腫瘤的發(fā)生和進展[2]。當(dāng)前，在惡性腫瘤的發(fā)生機制研究中，許多學(xué)者提出了基因協(xié)同作用假說，認為在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移的過程中，至少存在兩個或者兩個以上的功能各異但異常激活和/或失調(diào)的基因，它們各自發(fā)揮著不同作用，并有可能在時間和空間上相互配合，協(xié)同并促進了正常細胞的癌變。因此，本研究旨在觀察USP7和Ki-67在人大腸癌組織中的表達，以及兩者相關(guān)病理特征的關(guān)聯(lián)性和臨床意義，為發(fā)現(xiàn)新的大腸癌分子治療靶點和腫瘤標(biāo)記物提供臨床依據(jù)，以及為進一步探索USP7的分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2013年1月至2015年1月期間確診為大腸癌的手術(shù)標(biāo)本組織90例(存檔石蠟塊)作為實驗組；在這些確診病例中，隨機選取20例癌旁正常黏膜組織作為對照組。所有石蠟組織均具備完整的臨床病例資料，其臨床病理特征包括年齡、性別、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。所有患者術(shù)前均未接受放化療、靶向治療及腫瘤免疫治療等，術(shù)中均接受規(guī)范根治性手術(shù)切除，切除腸管組織上下切緣均為陰性。

1.2 方法

所有的手術(shù)標(biāo)本均用中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋保存。標(biāo)本組織連續(xù)切片厚度約為4 μm，隨后進行免疫組織化學(xué)染色實驗(Immunohistochemistry， ICH)。兔多克隆抗USP7抗體(Abcam， ab4080， 1：1 000)，鼠單克隆抗Ki-67即用型抗體(中國邁新生物有限公司， Kit-0005)。組織切片經(jīng)EDTA抗原修復(fù)和內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑處理完成后，滴加一抗放置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜，次日滴加二抗后置入37 ℃電熱恒溫箱內(nèi)孵育，DAB顯色，脫水，透明，封片。

1.3 觀察指標(biāo)

據(jù)陽性細胞所占比率及染色強度分別進行定性和分組。分級：組織切片內(nèi)無陽性細胞或陽性細胞<5%視為陰性(-)；組織切片內(nèi)陽性細胞占5%～19%視為弱陽性(+)；組織切片內(nèi)陽性細胞占20%～49%視為中度陽性(++)；組織切片內(nèi)陽性細胞≥50%視為強陽性(+++)。分組：USP7和Ki-67的陰性(-)及弱陽性(+)均被視為低表達組；USP7和Ki-67的中度陽性(++)及強陽性(+++)均被視為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較及獨立樣本計數(shù)資料差異性分析采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP7和Ki-67在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況

本實驗通過ICH實驗方法分別檢測了USP7和Ki-67在大腸癌組織與癌旁正常組織情況。在隨機選取的20例癌旁正常組織中，USP7低表達為20例，高表達為0例；而在90例大腸癌組織中，USP7低表達為34例，高表達為56例。同理，ki-67在20例癌旁正常組織中，低表達為20例，高表達為0例；在90例大腸癌組織中，低表達為39例，高表達為51例。說明USP7表達與Ki-67表達在正常組織和大腸癌組織之間均有顯著性差異(P<0.01)。

2.2 USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達關(guān)聯(lián)性

依據(jù)實驗結(jié)果，USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達具有一定的相關(guān)性。在90例大腸癌組織中，將USP7表達與Ki-67表達相互作比較，應(yīng)用卡方檢驗，結(jié)果提示USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達呈現(xiàn)出正相關(guān)，且差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達關(guān)聯(lián)性

2.3 USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)性

分別將USP7和Ki-67進行了與其相關(guān)的臨床病理學(xué)特征關(guān)聯(lián)性的檢測。在90例大腸癌組織中，USP7高表達、Ki-67高表達均與臨床病理學(xué)特征中的腫瘤組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，且差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 USP7和Ki-67在大腸癌組織中的表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)性

3 討論

USP7是目前被研究最為廣泛、最為熱點的一個泛素特異性蛋白酶。它能夠廣泛地與多種蛋白底物相結(jié)合，并對這些底物的多聚泛素鏈進行剪切，使泛素能夠釋放得以被重新利用，進而維持靶蛋白的穩(wěn)態(tài)，包括細胞免疫應(yīng)答、病毒的復(fù)制和感染、細胞的有絲分裂以及DNA的損傷修復(fù)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)USP7在多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、前列腺癌等疾病中呈現(xiàn)出高表達[4-5]。還有學(xué)者在非小細胞肺癌的體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn)USP7呈過表達狀態(tài)，當(dāng)下調(diào)USP7后可減慢癌細胞的增殖，并與Ki-67呈正相關(guān)，并得知USP7通過去泛素作用可調(diào)節(jié)Ki-67的穩(wěn)定性，促進癌細胞的增殖[6]。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，USP7和Ki-67在大腸癌組織中呈正相關(guān)性(表1)。在與大腸癌相關(guān)臨床病理學(xué)特征的探究中，USP7和Ki-67的高表達分別與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性(表2)。因此，我們大膽地推測在大腸癌中存在著USP7和Ki-67的相關(guān)性，Ki-67有可能為 USP7的底物之一，并受其泛素化/去泛素化的調(diào)節(jié)，而且USP7和Ki-67在大腸癌的病變進展中可能起了協(xié)同作用，但USP7和Ki-67之間的具體相互作用及聯(lián)系機制將有待于進一步地研究，成為下一步探索的新方向。

綜上所述，提示了USP7和Ki-67的高表達可能與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，并且與腫瘤惡性分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定相關(guān)性，還提示了這兩個基因在某種程度上可能存在協(xié)同作用，臨床上具有較大的綜合檢測價值，將會成為大腸癌患者臨床診療及判斷預(yù)后的潛在標(biāo)志物。