韓崇明，張瑩瑩，徐兆龍△

對(duì)比劑誘發(fā)的急性腎損傷，即對(duì)比劑腎?。╟ontrast induced nephropathy，CIN），是導(dǎo)致醫(yī)院獲得性急性腎損傷的第三大原因，可發(fā)生于30%以上接受碘化對(duì)比劑注射的患者［1］。CIN 的病理機(jī)制包括腎小管和血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接毒性作用、血流動(dòng)力學(xué)紊亂、氧化應(yīng)激等［2］。然而，其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，故缺乏有效的預(yù)防和治療方法。常規(guī)的抗氧化劑和堿性療法對(duì)有腎臟并發(fā)癥的對(duì)比劑腎病患者并無(wú)增益［3］。

近期有研究提出，對(duì)比劑腎病可能是由原位或浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞間相互作用導(dǎo)致的［4］，但是2種細(xì)胞間具體的通訊方式尚不清楚。外泌體是一種攜帶蛋白質(zhì)、微小RNA等活性成分的脂質(zhì)雙層囊泡，作為一種新的細(xì)胞間通訊方式而成為近年的研究熱點(diǎn)［5-6］。在高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型中，腎小管上皮細(xì)胞可通過(guò)外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活，巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體也可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和活化，表明外泌體在腎臟細(xì)胞間是一種普遍且關(guān)鍵的通訊方式。但是在對(duì)比劑腎病中，外泌體在腎臟細(xì)胞間的作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，可由巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌至胞外。本研究采用對(duì)比劑體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，分離獲得外泌體，從而觀察其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞功能的影響，并初步探討HMGB1在外泌體中的表達(dá)以及特異性阻斷藥物甘草酸苷的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）；無(wú)外泌體的胎牛血清、青鏈霉素、RMPI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；碘海醇購(gòu)自通用電氣藥業(yè)上海有限公司；甘草酸苷、佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；ExoQuick-TC Kit 外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Systems Biosciences 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；外泌體標(biāo)記試劑盒購(gòu)自遼寧潤(rùn)基生物科技有限公司；DAPI購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；兔抗CD63 抗體、兔抗TSG101 抗體、兔抗calnexin 抗體、小鼠抗HMGB1抗體、兔抗Toll樣受體4（TLR4）抗體、兔抗核因子κB（NF-κB）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、兔抗Cleaved caspase-3抗體、小鼠抗GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司。BX-63熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；H-7500 透射電子顯微鏡購(gòu)自日本Hitachi 公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Gel Doc XR 凝膠成像儀和CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 外泌體的分離與鑒定 THP-1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%無(wú)外泌體的胎牛血清、1%青鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫箱中。細(xì)胞用含100 nmol/L PMA的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)貼壁24 h。PBS 洗滌2 次后，更換為無(wú)血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，分別加入PBS、碘海醇（100 gI/L）、碘海醇+甘草酸苷（10 μmol/L）刺激24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、6 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后，采用ExoQuick-TC Kit 外泌體提取試劑盒分離外泌體。適量PBS重懸外泌體沉淀后，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，保存于-80 ℃冰箱。獲得的3 種外泌體分別記為NC-Exo、CIN-Exo、CIN-GL-Exo。外泌體的鑒定［7-8］：采用透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)；采用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)CD63、TSG101、calnexin 的表達(dá)，一抗分別為兔抗CD63抗體、兔抗TSG101 抗體、兔抗calnexin 抗體，稀釋比例均為1∶1 000。

1.3 外泌體的攝取 HK-2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%無(wú)外泌體的胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，將HK-2細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種至24 孔板。采用外泌體標(biāo)記試劑盒對(duì)外泌體進(jìn)行DiR 熒光標(biāo)記，加入50 μg/L已標(biāo)記外泌體至培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中。共培養(yǎng)24 h后，常規(guī)進(jìn)行多聚甲醛固定和DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，Con 組（加入等體積的PBS）、NC-Exo 組（加入50 μg/L 的NC-Exo）、CIN-Exo組（加入50 μg/L的CIN-Exo）、CIN-GL-Exo組（加入50 μg/L的CIN-GL-Exo）。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 檢測(cè)3種外泌體中HMGB1表達(dá)量，以及4組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 及HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。收集1×106個(gè)細(xì)胞，加入100 μL 的RIPA 裂解液，充分裂解2 min，12 000 r/min 離心10 min，留取上清液，進(jìn)行BCA蛋白定量。樣本經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育，一抗分別為小鼠抗HMGB1 抗體、兔抗TLR4 抗體、兔抗NF-κB 抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax 抗體、兔抗Cleaved caspase-3 抗體、小鼠抗GAPDH 抗體，孵育濃度均為1∶1 000。次日，漂洗3 次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，漂洗3 次，經(jīng)ECL顯色后，用凝膠成像儀拍照。采用Image J 軟件測(cè)量各條帶的灰度值，將Con 組目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH 的灰度值之比作為1，每組10 個(gè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4 組細(xì)胞的凋亡率 收集1×106個(gè)細(xì)胞，根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：加入500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，添加5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻，然后再加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫下避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，每份樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞。Annexin Ⅴ-FITC 與PI 染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。凋亡率=晚期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)4 組細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-αmRNA 的表達(dá) 用Trizol 試劑提取細(xì)胞中mRNA。PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，30 min。采用SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行qPCR，引物序列，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每組10個(gè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察顯示，THP-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體為圓形或類(lèi)圓形小囊泡，見(jiàn)圖1A。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，外泌體中含有表面標(biāo)志物蛋白CD63、TSG101，而不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白calnexin，見(jiàn)圖1B。

Fig.1 Identification of exosomes圖1 外泌體的鑒定

2.2 外泌體的攝取 熒光染色結(jié)果顯示，標(biāo)記DiR熒光素的外泌體可被HK-2 細(xì)胞攝取，聚集于核膜附近，見(jiàn)圖2。

Fig.2 The uptake of exosomes圖2 外泌體的攝取

2.3 3 種外泌體中HMGB1 表達(dá)量的比較 Western blot 結(jié)果顯示，CIN-Exo 的HMGB1 蛋白表達(dá)量（4.72±0.45）高 于NC-Exo（1.00±0.23）和CIN-GLExo（0.82±0.27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=531.500，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.4 4 組細(xì)胞凋亡情況的比較 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染結(jié)果顯示，CIN-Exo 組的細(xì)胞凋亡率［（20.38±2.54）%］高于Con 組［（3.73±0.76）%］、NCExo 組［（8.41±1.09）%］和CIN-GL-Exo 組［（10.50±1.27）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=240.200，P＜0.01），見(jiàn)圖4。Western blot 結(jié)果顯示，NC-Exo 組細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)量低于Con 組，而B(niǎo)ax、Cleaved caspase-3 表達(dá)量高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量低于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo 組，而B(niǎo)ax、Cleaved caspase-3 表 達(dá) 量 高 于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表1。

Fig.3 The protein expression of HMGB1 in exosomes detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)外泌體中HMGB1蛋白質(zhì)的表達(dá)

Fig.4 The apoptosis rates of cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining method圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率

Fig.5 The expression of apoptosis-related protein detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Tab.1 Comparison of the expression levels of apoptosisrelated proteins between 4 groups of cells表1 4組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

Tab.1 Comparison of the expression levels of apoptosisrelated proteins between 4 groups of cells表1 4組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F Bcl-2 1.00±0.19 0.58±0.23a 0.27±0.11ab 0.54±0.20ac 30.940＊Bax 1.00±0.15 1.93±0.27a 4.48±0.43ab 2.30±0.36abc 254.300＊Cleaved caspase-3 1.00±0.14 2.02±0.31a 3.97±0.46ab 1.88±0.35ac 167.400＊

2.5 4 組細(xì)胞炎性因子mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的比較 NC-Exo組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表達(dá)水平高于Con 組、NCExo 組、CIN-GL-Exo 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels ofinflammatory factors between 4 groups of cells表2 4組細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels ofinflammatory factors between 4 groups of cells表2 4組細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F IL-1β 1.00±0.14 1.59±0.22a 4.36±0.48ab 2.04±0.37abc 238.700＊IL-6 1.00±0.16 1.38±0.25a 3.50±0.41ab 1.46±0.39ac 149.600＊TNF-α 1.00±0.11 1.80±0.26a 4.93±0.55ab 2.26±0.41abc 253.000＊

2.6 4 組細(xì)胞HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 Western blot 結(jié)果顯示，NCExo 組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)量高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo 組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NFκB 表達(dá)量高于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖6。

Tab.3 Comparison of the expression levels of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins between 4 groups of cells表3 4組細(xì)胞HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins between 4 groups of cells表3 4組細(xì)胞HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F HMGB1 1.00±0.18 2.17±0.34a 3.03±0.45ab 1.95±0.29ac 76.820＊TLR4 1.00±0.22 2.48±0.29a 4.79±0.53ab 2.26±0.30ac 237.800＊NF-κB 1.00±0.17 2.25±0.26a 4.50±0.58ab 2.49±0.31ac 190.500＊

Fig.6 The expression of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)

3 討論

近期有研究發(fā)現(xiàn)，原位或浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可能在對(duì)比劑腎病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。循環(huán)中的對(duì)比劑被原位巨噬細(xì)胞攝取后，使Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體激活，大量生成并分泌IL-1β 等炎性因子，從而介導(dǎo)循環(huán)中的白細(xì)胞向腎臟遷移；另一方面，對(duì)比劑經(jīng)腎小球過(guò)濾后進(jìn)入腎小管，然后由腎小管上皮細(xì)胞重吸收后，再遞送給巨噬細(xì)胞，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大。由此可見(jiàn)，巨噬細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等不同類(lèi)型細(xì)胞間緊密聯(lián)系，在腎損傷中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，但是細(xì)胞間通訊方式尚不清楚。外泌體是一種雙層質(zhì)膜包裹的囊泡樣小體，直徑為50～150 nm，可由大多數(shù)細(xì)胞分泌［9-10］。外泌體中包含著豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA等活性成分，可將重要的信號(hào)分子遞送至靶細(xì)胞，從而發(fā)揮各種調(diào)節(jié)作用［11］。在對(duì)糖尿病腎病的研究中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以激活腎小球系膜細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，而且腎小球系膜細(xì)胞來(lái)源的外泌體也可介導(dǎo)足細(xì)胞損傷［12-14］。因此，筆者認(rèn)為在對(duì)比劑腎病中，各細(xì)胞間的通訊也可能通過(guò)外泌體實(shí)現(xiàn)。

外泌體的提取與鑒定是本研究的首要環(huán)節(jié)。本研究采用商品化試劑盒通過(guò)沉淀法從巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離得到外泌體，與傳統(tǒng)的超速離心法相比較，具有分離快、產(chǎn)量大、純度高的優(yōu)點(diǎn)，是較為常用的分離方法［15］。外泌體上富含多種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多囊泡胞內(nèi)體產(chǎn)生相關(guān)蛋白等，與外泌體的產(chǎn)生與功能有關(guān)，可作為外泌體鑒定的特征性標(biāo)志物。本研究采用Western blot 檢測(cè)CD63 和TSG101 的表達(dá)，結(jié)果顯示在分離的外泌體中兩者均呈高表達(dá)，而未檢測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白calnexin表達(dá)，提示其不含其他細(xì)胞成分，純度較高，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道結(jié)果一致。外泌體主要由內(nèi)吞的方式被攝取，本研究也通過(guò)熒光標(biāo)記的方法證實(shí)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可被HK-2細(xì)胞攝取，且主要分布于核膜附近，即胞漿中。但是，本研究未對(duì)外泌體攝取的具體通路進(jìn)行深入探討，據(jù)陳曦等［16］分析可能與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路或膽固醇等非網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑有關(guān)，這有待今后進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可否介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷，本研究使用分離得到的外泌體刺激腎小管上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示與Con組、NCExo組比較，CIN-Exo組細(xì)胞的凋亡率以及凋亡促進(jìn)蛋白Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)量均升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達(dá)量降低，提示巨噬細(xì)胞在碘海醇刺激后分泌的外泌體可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡。郭銀鳳等［17］報(bào)道，高糖環(huán)境活化的巨噬細(xì)胞上清液可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果一致，并進(jìn)一步指出外泌體成分在細(xì)胞上清液中的關(guān)鍵作用。此外，郭銀鳳等［17］認(rèn)為，上清液中含有的高濃度炎性因子是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子。本研究結(jié)果顯示，CIN-Exo 組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 水平高于Con組和NC-Exo組，證實(shí)了炎性因子在外泌體促凋亡效應(yīng)中的作用。值得注意的是，與Con 組比較，NC-Exo組細(xì)胞的凋亡率及炎性因子表達(dá)水平也有所上調(diào)，提示巨噬細(xì)胞在不經(jīng)碘海醇誘導(dǎo)的情況下，依然可以對(duì)腎小管上皮細(xì)胞造成一定損傷。

HMGB1 是真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在的非組蛋白染色體蛋白，在胞核內(nèi)主要發(fā)揮穩(wěn)定核小體、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用，但是在各種因素刺激下可分泌至細(xì)胞外，與細(xì)胞表面受體TLR4結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［18-19］。為了進(jìn)一步探究外泌體中發(fā)揮損傷效應(yīng)的活性成分，本研究對(duì)這種可介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子HMGB1 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HMGB1 在碘海醇誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞外泌體中表達(dá)顯著升高，提示外泌體HMGB1 可能是發(fā)揮損傷效應(yīng)的關(guān)鍵分子。甘草酸苷可與HMGB1直接結(jié)合，從而發(fā)揮特異性抑制劑的作用［20-21］。本研究結(jié)果顯示，甘草酸苷可顯著抑制碘海醇對(duì)外泌體HMGB1的上調(diào)效應(yīng)，進(jìn)一步降低腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率與炎性因子表達(dá)水平，下調(diào)HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，本研究揭示了巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體及其HMGB1 高表達(dá)在對(duì)比劑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，為對(duì)比劑腎病發(fā)病機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的視角。甘草酸苷作為傳統(tǒng)中藥材甘草的主要活性成分，本研究為其用于對(duì)比劑腎病的治療提供了一定的理論依據(jù)。