鄭寶勝 葛敬如 蘇昕（通訊作者）

（沈陽藥科大學(xué) 遼寧 沈陽 110016）

植物枯萎病是由寄生的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的真菌性傳染性疾病，尖孢鐮刀菌通過產(chǎn)生出有毒物質(zhì)鐮刀菌素擴(kuò)散導(dǎo)致病株葉片枯黃而死[1]。由于農(nóng)業(yè)防治的局限性和傳統(tǒng)的化學(xué)防治容易殘留農(nóng)藥，對人體有危害和污染環(huán)境，基于微生物及其代謝產(chǎn)物的生物防治方法已經(jīng)成為全球植物病害防治的主要發(fā)展方向[2]。因此，研究微生物及其活性物質(zhì)能夠有效地幫助開發(fā)新型農(nóng)藥，同時也是闡明其作用機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。作為菌株的生物防治機(jī)制之一，水解酶越來越多地被用作評估生物防治細(xì)菌生物防治潛力的指標(biāo)[3-4]。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，但當(dāng)芽孢桿菌被用作控制植物病原菌的微生物制劑時，抗菌作用的發(fā)揮主要是由于其產(chǎn)生脂肽類抗生素[5]。本實驗旨在通過測定芽孢桿菌的水解酶活性和解磷能力評價其生防價值，并對芽孢桿菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌跟蹤測定，從而初步研究其抑菌機(jī)制。

1.材料

1.1 主要材料

尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysparm)——沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)；

芽孢桿菌（Bacillus siamensis）X13——沈陽藥科大學(xué)。

1.2 主要培養(yǎng)基

沙氏培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基）；

土豆-蔗糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；

胞外酶活性測定基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

瓊脂粉——天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

蒸餾水——沈陽藥科大學(xué)；

生理鹽水——0.85%生理鹽水；

染色劑——盧戈氏碘液；0.1%剛果紅染液。

1.3 主要設(shè)備

臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；

立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；

HZQ-QX 全溫振蕩器；

RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2.方法

2.1 蛋白酶，淀粉酶和纖維素酶活性的測定

將X13 分別接種在蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察是否有透明圈產(chǎn)生，測量透明圈和菌落直徑；按以下公式分別計算出三種酶活性：

酶活性=透明圈直徑/菌落直徑

2.2 解磷能力測定

將X13 菌株加入NB 培養(yǎng)基中于37℃搖培24 小時，用作種子溶液。將菌液分別接種于NBRIP 無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天，觀察有無解磷透明圈。根據(jù)是否有解磷圈來確定其對無機(jī)磷和有機(jī)磷的解磷作用。

2.3 X13 菌發(fā)酵液的制備

將菌株X13 在37℃接種到種子培養(yǎng)基(同發(fā)酵培養(yǎng)基成分)中，作為種子液以180r/min 培養(yǎng)24 小時。將種子液以5%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后置于37℃的搖床中，以180r/min 培養(yǎng)48 小時。

2.3.1 脂肽粗提物的制備 （1）調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 到8.0，使脂肽盡量多地溶解在發(fā)酵液中，并在室溫下以3500r/min 離心45min；（2）取上清液，調(diào)節(jié)pH 到 2.0，并在4℃下靜置12 小時，在室溫下以3500r/min 離心45min，上清液經(jīng)拮抗實驗驗證，沒有抑菌活性，抑真菌活性物質(zhì)主要留存在沉淀中，因此棄去上清液；（3）用pH 為2.0 的鹽酸洗滌沉淀兩次，再以甲醇少量多次萃取(萃取3 次)；（4）萃取液于30℃減壓蒸干溶劑，得到的淡黃色粉末即為脂肽粗提物，溶解在甲醇中，使其終濃度為5 g/L 左右，避光保存于ep 管中。

2.3.2 脂肽粗提物的抑菌活性跟蹤測定 （1）制備單孢子懸液：取尖鐮孢菌斜面，加入5ml 無菌生理鹽水，刮下菌苔，倒入含有玻璃珠的100ml 滅菌三角瓶中，振蕩20 min，將孢子分散并活化，用過濾裝置進(jìn)行過濾，得到單孢子懸液，備用。（2）制備混菌平板：將滅菌后的PDA 培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個平板15mL 左右。吸取尖鐮孢菌孢子懸液150uL，加入到裝有50 mL 已滅好菌且溫度冷卻到55℃以下PDA 培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖勻倒入已淺淺凝固一層PDA 培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻成混菌平板，備用。（3）濾紙片法測定脂肽粗提物的抗菌活性：將待測脂肽粗提物溶于甲醇中，使其濃度為5mg/ml，將直徑為6mm 的無菌濾紙片加入培養(yǎng)基中，并將10μL 待測脂肽粗提物逐滴添加到濾紙片上，以等量純甲醇作為對照。將平板置于28°C 溫育5 天，觀察且記錄下抑菌狀況。

3.結(jié)果

酶活性= 透明圈直徑/ 菌落直徑，蛋白酶活性：30.2mm/7.6mm=3.97；淀粉酶活性：12.5mm/9.1mm=1.37；纖維素酶活性：29.5mm/7.1mm=4.15。三種水解酶均有活性，纖維素酶活性最高，蛋白酶其次，淀粉酶最低。無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：X13 菌落邊緣出現(xiàn)輕微透明圈，因此有輕微的解無機(jī)磷作用。有機(jī)磷培養(yǎng)基：X13 菌落周圍無透明圈產(chǎn)生。濾紙片法測定脂肽粗提物的抑菌圈直徑約32.0mm，而甲醇對照組則無抑菌活性?；钚愿櫆y定實驗結(jié)果表明，脂肽粗提物對于尖鐮孢菌具有良好的抑菌活性。

4.結(jié)論與討論

（1）菌株X13 可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，具有較強(qiáng)的生物防治潛力和生物防治價值；（2）菌株X13 具有解無機(jī)磷能力，未表現(xiàn)出解有機(jī)磷能力；（3）菌株X13 的脂肽粗提物具有明顯的抑菌活性，可拮抗尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。通過本次實驗測定芽孢桿菌具有水解酶活性和降解無機(jī)磷能力，及其次級代謝產(chǎn)物脂肽粗提物具有較強(qiáng)的抑菌活性，但脂肽粗提物中主要抑菌物質(zhì)還有待進(jìn)一步分離、純化及鑒定。