焦亞飛，劉樹林，葉 升，石德順，黃 奔

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004）

在人的基因組文庫研究中，通過高通量測序技術(shù)已經(jīng)揭示了人類基因組文庫，并且在其中發(fā)現(xiàn)了大量非編碼基因[1]。非編碼RNA 根據(jù)其長度可以分為小RNA和lncRNA，它曾被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄過程的“噪音”，是RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。在lncRNA 的研究中發(fā)現(xiàn)，相比編碼蛋白的基因，lncRNA 更具有組織特異性，且lncRNA 在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的修飾都發(fā)揮著重要的功能[2]。有關(guān)lncRNA 的研究已經(jīng)發(fā)表論文超過3 000 篇，涉及細胞分化、個體發(fā)育、人類疾病（如阿爾茲海默癥、癌癥等）研究領(lǐng)域[3-6]。

卵母細胞是生殖醫(yī)學(xué)、細胞生物學(xué)、物種保護等領(lǐng)域的重要研究對象，與雄性配子不同，卵母細胞可以在體外培養(yǎng)成熟[7]。卵母細胞體外成熟的質(zhì)量對卵母細胞的孤雌激活、體外受精、核移植、胞質(zhì)注射等胚胎發(fā)育具有重要影響。然而，體外成熟的卵母細胞與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，存在著核質(zhì)成熟不同步、囊胚率低、多精受精率高等問題。探究卵母細胞體外成熟存在的問題，需要了解卵母細胞成熟過程中的調(diào)控機制，尤其是通過高通量測序技術(shù)探究卵母細胞成熟過程中RNA 表達情況，這一技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，lncRNA 參與卵母細胞成熟過程中的各個階段。本文綜述了動物繁殖相關(guān)lncRNA 的研究進展，以期通過lncRNA 的調(diào)控作用解釋卵母細胞成熟過程中存在的問題，為深入探究家畜繁殖機制提供理論基礎(chǔ)。

1 lncRNA 的作用機制及生物學(xué)功能

1.1 lncRNA 的作用機制 lncRNA 作為基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因子，通過不同方式對基因進行調(diào)節(jié)[8]，其作用機制主要有5 種形式：①lncRNA 可以作為信號分子與轉(zhuǎn)錄因子相緊密結(jié)合，或在特定時間和空間上通過信號通路調(diào)控基因表達；② lncRNA 可以作為誘導(dǎo)分子阻礙轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白類物質(zhì)、染色體相結(jié)合或是阻礙蛋白因子與細胞核相結(jié)合，如lncRNA 可以與miRNA 相結(jié)合；③lncRNA 作為引導(dǎo)分子引導(dǎo)染色質(zhì)修飾酶或目的基因，通過順式或反式結(jié)構(gòu)與遠距離靶基因相結(jié)合；④lncRNA 可以作為支架分子使許多復(fù)雜的蛋白質(zhì)形成核糖體蛋白復(fù)合物，這種復(fù)合物可以在染色質(zhì)中影響組蛋白修飾；⑤ lncRNA 也可以作為增強子，起到啟動子與增強子之間連接蛋白的作用。

1.2 lncRNA 的生物學(xué)功能 根據(jù)lncRNA 的調(diào)控方式可以將其在生物學(xué)上的功能分為表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3 種層面[9]：①表觀遺傳調(diào)控，lncRNA 可以通過募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物結(jié)合至特定基因位點，在轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮基因的調(diào)控作用；②轉(zhuǎn)錄中調(diào)控，lncRNA 可以對控制蛋白編碼基因的啟動子進行直接或間接的調(diào)控，這類lncRNA 可能會與基因轉(zhuǎn)錄蛋白相結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，lncRNA 也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，對靶基因的表達產(chǎn)生影響；③轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，lncRNA 可以通過堿基互補配對原則對蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因進行加工和修飾。此外，lncRNA 也可以像ceRNA（competing endogenous RNA）結(jié)合miRNA 的作用方式，對靶基因的轉(zhuǎn)錄過程進行調(diào)控[10]。

2 lncRNA 對動物卵母細胞成熟的調(diào)控

卵母細胞成熟質(zhì)量對受精和胚胎發(fā)育的潛力具有重要作用。目前體外成熟的卵母細胞質(zhì)量低于體內(nèi)成熟的卵母細胞，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對體外成熟卵母細胞進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)成熟過程中存在大量差異表達的lncRNA，表明lncRNA 與卵母細胞成熟具有潛在聯(lián)系[11]。lncRNA 廣泛參與卵母細胞成熟的生物學(xué)過程，在卵丘顆粒細胞擴展、激素水平、卵母細胞核質(zhì)成熟方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.1 lncRNA 參與卵丘顆粒細胞擴展的調(diào)控 卵丘細胞對卵母細胞的成熟起到至關(guān)重要的作用，卵丘細胞主要通過胞質(zhì)磷酸化、去磷酸化、氨基酸攝入以及相關(guān)第二信使IP3、cAMP 作用來調(diào)節(jié)卵母細胞成熟，同時卵丘細胞的擴展也可以減少成熟分裂的抑制因子，從而解除其對卵母細胞減數(shù)分裂阻滯的束縛[12]。

Bouckenheimer 等[13]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)人卵母細胞周圍的卵丘細胞為卵母細胞運輸大量的營養(yǎng)和物質(zhì)，包括mRNA 和lncRNA，表明lncRNA 通過卵丘細胞對卵母細胞的成熟具有重要作用。研究表明，質(zhì)量差的人卵丘卵母細胞復(fù)合體中顯著下調(diào)的基因lncRNA-Y00062參與對靶基因NEK7 的調(diào)控[14]，而NEK7 是一個在紡錘體組裝和有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用的基因，表明lncRNA-Y00062對卵母細胞成熟具有調(diào)控作用[15]。Warzych 等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNAENST00000502390在質(zhì)量差的卵丘細胞復(fù)合體中表達量高，其與超長鏈脂肪酸延伸酶5（Elongation of Very-Long-Chain Fatty Acids Protein5，ELOVL5）共同參與調(diào)節(jié)卵母細胞成熟及排卵過程的發(fā)生。

通過多人多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）的卵丘細胞復(fù)合體的研究揭示了lncRNA 對卵母細胞轉(zhuǎn)錄的調(diào)控關(guān)系。Xin 等[17]選取XLOC_011402、ENST00000454271、ENST00000433673、ENST00000450294、ENST000004324315 個差異lncRNA采用QRT-PCR 對芯片結(jié)果進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多差異表達的lncRNA 都是從2 號染色體轉(zhuǎn)錄而來，可能作為增強子調(diào)控其臨近的蛋白編碼基因。與正常女性相比，PCOS 患者的卵丘細胞中有623 個lncRNA 和260 個mRNA 顯著上調(diào)或下調(diào)，提示PCOS 患者和正常女性中l(wèi)ncRNA 的差異表達可能是PCOS 發(fā)生的原因之一，可能影響卵母細胞發(fā)育[17]。

Yerushalmi 等[18]在緊湊型和擴張型卵丘細胞之間鑒定了1 746 個差異表達基因，這些基因大多參與細胞生長、細胞間信號傳導(dǎo)和相互作用及細胞外基質(zhì)和類固醇生成；在差異表達的基因中，發(fā)現(xiàn)89 個長鏈非編碼RNA，其中12 個lncRNA 參與顆粒細胞發(fā)育過程的基因內(nèi)含子中，其中整合素α6 反義RNA（Integrin Alpha6 Antisense RNA，ITGA6-AS）的表達在MII 期卵母細胞-放射冠-卵丘復(fù)合體（Oocyte-Corona-Cumulus Complex，OCCC）的卵丘細胞中顯著上調(diào)，而其靶基因ITGA6則顯著下調(diào)。整合素α6β1 是顆粒細胞層黏連蛋白的受體，它們在顆粒細胞中的相互作用能夠增強細胞的存活和增殖能力并調(diào)節(jié)類固醇生成[19]。但ITGA6-AS是否直接調(diào)節(jié)ITGA6目標(biāo)基因的表達需要進一步研究。Yerushalmi 等[18]實驗表明，lncRNA 轉(zhuǎn)錄可能有助于調(diào)節(jié)卵丘的擴張和卵母細胞的成熟。

2.2 lncRNA 參與激素水平的調(diào)控 激素對卵母細胞成熟、受精以及胚胎發(fā)育都起著重要的促進作用。絕大多數(shù)卵母細胞成熟培養(yǎng)體系中都會添加各種激素。Singh等[20]研究發(fā)現(xiàn)，豬卵母細胞成熟體系中加入雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）可降低胚泡損傷率。

抗繆勒氏激素（AMH）對哺乳動物雄性分化過程中繆勒氏管的退化起重要作用，主要作用于成年動物卵巢顆粒細胞、睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞[21]。AMH 的特異性作用是通過其受體AMH II 型受體（Amhr2）發(fā)揮的，但Amhr2基因被特異性激活的機制尚不完全清楚。Kimura 等[22]在卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞中發(fā)現(xiàn)了一種長鏈非編碼RNA-lncRNA-Amhr2，是從Amhr2基因上游轉(zhuǎn)錄而來的，在原代顆粒細胞中，lncRNAAmhr2的下調(diào)導(dǎo)致Amhr2messnger RNA 水平下降，瞬時報告基因檢測顯示，lncRNA-Amhr2激活增加了Amhr2啟動子活性，該活性與lncRNA-Amhr2在小鼠顆粒細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的OV3121 細胞中的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。此外，通過Tet-on 系統(tǒng)，lncRNA-Amhr2轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)顯著提高了OV3121 細胞中Amhr2啟動子活性。這些結(jié)果表明，lncRNA-Amhr2通過增強啟動子活性，在卵巢顆粒細胞的Amhr2基因激活中發(fā)揮作用。脯氨酰寡肽酶（Prolyl Oligopeptidase，POP）是一種能特異性水解多肽鏈中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，POP參與肽類激素和神經(jīng)肽的成熟與降解[23]。Matsubara等[24]比較了小鼠POP 的基因組序列，在相鄰的基因間發(fā)現(xiàn)6 個保守的非編碼序列（Conserved Non-Coding Sequences，CNSs），從這些CNSs 中轉(zhuǎn)錄出4 個長鏈非編碼RNA，其中LncPrep+96kb 的表達模式與POP的表達模式相關(guān)。lncPrep+96kb 由于轉(zhuǎn)錄起始位點的不同而被轉(zhuǎn)錄為2 種形式，定位于細胞核和細胞質(zhì)中，但細胞核中存在較多的lncPrep+96kb。當(dāng)將lncPrep+96kb敲入小鼠卵巢原發(fā)性顆粒細胞和肝細胞時，2 個細胞的POP 表達均下降，相反，lncPrep+96kb 的過表達僅在顆粒細胞中增加了POP 的表達，由于lncPrep+96kb在激素處理的卵巢中上調(diào)的時間與POP 相同，表明lncRNA 可能在顆粒細胞的POP 基因激活中發(fā)揮作用，通過一些激素的合成從而影響了卵母細胞的成熟[24]。

Liu 等[25]通過PCOS 患者和健康女性的GCs 的轉(zhuǎn)錄組表達譜分析，發(fā)現(xiàn)lincRNA HCG26在POCS 患者的卵巢顆粒細胞中呈高表達，其表達水平與卵巢竇卵泡數(shù)相關(guān)，通過在人卵巢顆粒細胞系KCN 中下調(diào)HCG26的表達抑制了細胞增殖，增加芳香化酶基因表達和E2的產(chǎn)生，提示lincRNA HCG26可能在調(diào)控PCOS 顆粒細胞增殖和卵泡生長具有重要作用。

2.3 lncRNA 參與卵母細胞核質(zhì)成熟的調(diào)控 在整個卵母細胞成熟過程中，涉及的過程主要可以分為細胞質(zhì)成熟和細胞核成熟。細胞質(zhì)成熟主要包括細胞器的形態(tài)、卵母細胞骨架以及成熟過程中需要的RNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白合成；核成熟主要包括生發(fā)泡破裂、染色體復(fù)制、同源染色體分離等過程[26]。

Karlic 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在卵母細胞成熟過程中同樣發(fā)揮巨大作用，卵母細胞內(nèi)含有休眠狀態(tài)的lncRNA，當(dāng)mRNA 在卵母細胞內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能、調(diào)控細胞質(zhì)聚腺苷酸化時，可以激活卵母細胞內(nèi)的lncRNA，lncRNA 在促進細胞質(zhì)聚腺苷酸化的過程中表現(xiàn)為與mRNA 協(xié)同狀態(tài)，因此lncRNA 可能在調(diào)控卵母細胞成熟尤其是胞質(zhì)成熟方面發(fā)揮重要作用。Bouckenheimer 等[28]分析了公開可用的RNA 測序數(shù)據(jù)庫，以識別在減數(shù)分裂中期（MII）卵母細胞（BCAR4、C3orf56、TUNAR、ooeg-as1、CASC18和LINC01118）和卵丘細胞（NEAT1、MALAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1）中大量存在的lncRNA，這些數(shù)據(jù)通過使用獨立卵母細胞和卵丘細胞的QRT-PCR 分析得到驗證。通過構(gòu)建lncRNA-mRNA 共表達網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測所鑒定的lncRNA 的功能。這一分析表明MII 期卵母細胞lncRNA 可能參與染色質(zhì)重構(gòu)和驅(qū)動胚胎早期發(fā)育。

果蠅Oskar（Osk）mRNA 具有不同尋常的編碼和非編碼功能。Osk是一種信使RNA，它編碼1 種蛋白，這種蛋白特別表達于卵母細胞的后部。這種空間受限的部署依賴于mRNA 的定位程序以及翻譯的抑制和激活，所有這些都依賴于主要位于mRNA 的3' untranslation region（UTR）的調(diào)控元件[29]。3' UTR 還介導(dǎo)了Osk的非編碼功能，招募各種調(diào)控因子影響卵子形成后期極性的建立，這對卵母細胞發(fā)生的進展至關(guān)重要[30]。在哺乳動物中還沒有發(fā)現(xiàn)類似果蠅Osk的lncRNA，因此在哺乳動物中可能存在類似的lncRNA 在卵子發(fā)生過程中起著重要的作用。

3 展 望

lncRNA 是調(diào)控生殖細胞命運和功能的一類重要基因。目前與繁殖有關(guān)的lncRNA 的研究處于初始階段，lncRNA 的作用及機制不斷被發(fā)現(xiàn)。已有研究開始逐步揭示lncRNA 在卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟、早期胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控作用，研究主要積集中于人和小鼠方面，與大動物繁殖相關(guān)的lncRNA 的功能和機制還處于未知狀態(tài)，還需要不斷地深入研究和完善。通過模式動物的lncRNA 相關(guān)研究，將為家畜繁殖的機制和優(yōu)化家畜繁殖力提供理論參考。