李沛文 吳成余

吉林煙草工業(yè)有限責任公司 吉林長春 130000

多酚氧化酶（PPOs）是植物中廣泛存在的一類銅蛋白物質(zhì)。在煙草中，多酚氧化酶不但在煙草的整個成長過程中擔當著重要的角色，而且影響著煙葉的顏色和香吃味，所以對煙草的多酚氧化酶的研究也有重要的應用前景。本文嘗試從新鮮煙葉中提取多酚氧化酶，并進行分離和純化[1]。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

多功能食物攪拌機；超聲波儀；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵；海爾冰箱；LC213 型干燥箱；Z 型系列層析柱；BS-100A 型自動部分收集器；HL-2 恒流泵；2000ml 梯度混合器；HD-21-88 核酸蛋白檢測儀；721 分光光度計；透析袋； 800 型離心機；PHS-2C型精密酸度計；XS-204 電子天平；磁力攪拌器；可調(diào)式電爐等。

1.2 藥品及材料

新鮮煙葉； Tris；聚乙烯吡咯烷酮；乙二胺四乙酸二鈉；抗壞血酸；半胱氨酸；磷酸二氫鈉；氯化鈉；硫酸銨；石英砂；十二烷基磺酸鈉；N,N,N,N- 四甲基乙二胺；甲叉丙烯酰胺；丙烯酰胺；過硫酸銨；無水甲醇；冰乙酸等。

2 實驗步驟

2.1 前處理

2.1.1 采集煙葉

從煙田采集一定量的新鮮成熟煙葉，用洗潔劑將其表面的灰塵和污漬清洗干凈，將煙葉切成小的碎片。

2.1.2 粉碎煙葉

把所收集的新鮮煙葉1000g 左右，加入冷丙酮溶液1500mL，浸泡過夜，再用風扇將其吹干，然后再用食物粉碎機粉碎。

2.1.3 均漿煙沫

在粉碎的煙沫中加入pH=7.5 0.05mol/L 的磷酸鹽緩沖液1800mL，再加入12g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。再加入Vc4g，EDTA3g，Cys0.6g。

2.1.4 超聲處理

將均漿物在冰水浴中用超聲波處理一小時進行細胞破碎。

2.2 粗分級

（1）將處理的物質(zhì)用六層紗布過濾，收集濾液，加入固體硫酸銨至30% 的飽和度，邊加邊攪拌使之全部溶解，在4℃的條件下靜置4 小時，然后離心取上清液，再往上清液中加入80% 摩爾濃度的硫酸銨。4℃條件下靜置，然后再離心，收集沉淀。

（2） 得 到 的 沉 淀 用10mL 0.05mol/L 的Tris-HCl 緩 沖 液（pH=7.5）溶解并在此緩沖液中透析平衡20 小時，這其中每5 小時換一次透析溶液。

（3）將沉淀透析脫鹽后，用風扇吹，使之濃縮，準備上Sephadex A50 柱（3.5×70cm）。

2.3 細分級

2. 3.1 柱色譜的準備實驗

稱取50g Sephadex A-50 置于燒杯中，加入適量的0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液浸泡經(jīng)48 小時，除去上層渾濁液中小顆粒。然后將膠液放在真空干燥器中，脫氣20-30 分鐘，然后裝柱，加滿緩沖液，蓋上柱塞連接好管路[2]。

2.3.2 柱色譜分離

整個過程為首先用DEAE-Sephadex A-50 柱進行層析分離，兩部分活性成分分別收集，并用透析袋脫鹽濃縮到10mL，用0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）平衡。得到PPO Ⅰ和PPO Ⅱ兩部分，然后分別再經(jīng)過Sephadex G-75 柱（1.5×100cm）分離，收集活性部分并用透析袋脫鹽濃縮到10mL 后用0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）平衡，然后再分別過DEAE-Sephadex A-50柱（3×60cm）。

2. 3.3 酶活力和蛋白質(zhì)含量的測定

多酚氧化酶的活性測定和蛋白質(zhì)含量測定采用分光光度法，以鄰苯二酚為底物，在0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）中，420nm 的波長下測定酶活力，280nm 的波長下測定蛋白質(zhì)含量。酶活力單位以如下方法定義，即420nm 的波長下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘引起0.01 單位的摩爾吸光度的增加為一個酶活力單位。

表1 分離過程中每一步的相對活力

1- 粗提液；2- 加入30% 硫酸銨后溶液的相對活力；3- 加入80% 硫酸銨后沉淀的相對活力；4- 加入80% 硫酸銨后清液的相對活力；5-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅰ的相對活力；6-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅱ的相對活力。

3 結果與討論

多酚氧化酶的分離分為沉淀法的前處理和層析柱分離的后處理兩個步驟。前處理中由于多酚及它們的氧化產(chǎn)物的存在抑制了多酚氧化酶的活性，加入一定量的PVP 能降低醌類物質(zhì)的多聚體，從而在一定的程度上能降低多酚對蛋白分離的負面影響。

后處理經(jīng)層析柱分離，從60-130 管發(fā)現(xiàn)PPO 活性部分，被定義為PPO Ⅰ。PPO Ⅱ比我們前面所發(fā)現(xiàn)的PPO Ⅰ在DEAESephadex A-50 層析柱較后的管數(shù)出現(xiàn)，它的相對活力比PPO Ⅰ要大。在280nm 的波譜圖上我們可以看到，一共有四個峰，為了確定其活性峰，我們作出了420nm 處的波譜圖，從420nm 波譜圖與280nmm 波譜圖可以得出（圖1），峰I 和峰IV 為活性峰，但它們的吻合程度并不好，說明PPO 中還含有雜蛋白，因此還必須繼續(xù)純化PPO[3]。

圖1 粗蛋白過 DEAE-Sephadex A-50 柱時的總洗脫曲線，其中A 為280nm 時的洗脫曲線，B 為420nm 時的洗脫曲線。色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

將過A-50 層析柱后活性較高的PPOI 和PPOII 收集起來裝進透析袋進行濃縮，脫鹽再分別過Sephadex G-75，然后脫鹽后再分別過A-50 柱層析，結果在420nm 作出的波譜圖與在280nm 作出的波譜圖吻合得比較好（圖3.2 和圖3.3），說明PPOI 和PPOII提純得比較好，其中沒有雜蛋白了[4]。

圖2 過DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后又一次過DEAE- Sephadex -A50 后PPOI 在280nm（圖A）和420nm（圖B）的總洗脫曲線色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

圖3 過DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后 又一 次 過DEAE- Sephadex -A50 后PPOII 在280nm（ 圖A） 和420nm（圖B）的總洗脫曲線色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃[5]。

但本文對PPO 只是作了初步試探性的研究，還有不少工作有待進一步開展，如怎樣進一步選擇適宜的分離手段和條件對多酚氧化酶同工酶進行分離和純化，以及如何利用更新的方法對多酚氧化酶性質(zhì)進行研究等，都有待更深入的研究。