盧英

山東齊都藥業(yè)有限公司 山東臨淄 255400

1 材料與方法

1.1 材料

某化驗室藥廠，截至2018 年11 月31 日使用了不同時間的新風系統(tǒng)中的超細玻璃纖維空氣濾膜，分為3 個樣本組，每個樣本組含有3 個重復樣本（表1）。所有樣本裝入無菌采樣袋中，在4℃條件下運輸至實驗室，4h 內處理。

表1 不同使用時間的空氣濾膜樣本編號

1.2 樣本處理

①每個樣本取15-20 片空氣濾膜剪碎，分裝入含有0.9% 生理鹽水的50mL 無菌離心管中，40C，200g 離心2h；②輕輕渦旋，用0.22μmMCE 微孔濾膜過濾；③收集微孔濾膜，剪碎后用于提取樣本的宏基因組DNA[1]。

1.3 16SrDNA 擴增子測序

各樣本的宏基因組DNA 用無菌水稀釋至終濃度1ng/μL， 并 以此為模板， 利用16SV3-V4 區(qū) 通 用 引物進行PCR擴增。PCR 產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收后， 使用IonPlusFragmentLibraryKit48rxns 建庫試劑盒構建宏基因組文庫，經過定量和檢測后進行高通量測序，測序方法為單端測序法。

1.4 測序數據處理

使用Cutadaptv1.9.1 先對reads 進行初步處理得到原始數據，然后進行去除嵌合體序列的處理，得到有效數據。利用Uparsev7.0.1001 對所有樣品的全部有效數據進行聚類，默認以97% 的一致性將序列聚類成為操作分類單元，同時會選取OTU 的代表性序列，依據其算法原則，篩選OTU 中出現頻數最高的序列作為代表序列；對OTU 序列進行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA132 的SSUrRNA 數據庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在各個分類水平。

2 結果與討論

2.1 測序數據分析

16SrDNA 擴增子測序得到的有效數據數目在45878-64178范圍內，平均長度395-415nt，有效數據中堿基質量值大于20 的堿基所占的百分比超過82%，數據得率90% 以上[2]。

2.2 OTLs 聚類分析

在97% 相似性水平上進行聚類，3 個樣本組共有OTU 數量達1015 個，樣本組JN6JN9 和JN12 特有的OTU 數量分別為303484 和274 個?；贠TU 的物種分類分析，細菌種類覆蓋31個門725 個屬。其中，樣本組JN9 中特有的OTU 數目最多，預示含有較多的特有微生物種類。

2.3 門水平Top10 物種相對豐度及優(yōu)勢物種差異分析

對OTU 的代表序列進行物種注釋，根據物種注釋結果，選取3 個樣本組在門分類水平上最大豐度排名前10 的物種進行物種相對豐度和優(yōu)勢物種差異分析，結果顯示各樣本中以金黃色葡萄球菌（占比27%-54%）、大腸埃希菌（占比13%-30%）、銅綠假單孢桿菌（占比12%-30%）和枯草桿菌（占比4% 一10%）的微生物居多，4 種細菌門總豐度平均為90%。許多對人體有害的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌等都屬于這些種類。在生活環(huán)境中，金黃色葡萄球菌細菌比較常見，即使經過消毒殺菌，其再生能力仍然較強。大腸埃希菌細菌即使處于一些抗生素環(huán)境中也具有較強的生命力。放線菌中絕大多數是有益菌，也有極少數會引起人類的疾病?？莶輻U菌的一些細菌可以釋放細胞神經毒素從而使人體發(fā)生炎癥性神經變性，甚至己經可以作為某些環(huán)境下的污染指標[3-4]。

3 結語

采用高通量測序技術對樣本16SrDNA 片段進行測序，可以獲得準確的序列信息和更大的數據量，從而在后續(xù)分析中獲得更加深人、全面和可靠的結果。將此技術引人室內空氣凈化系統(tǒng)的細菌多樣性分析中，可以提供更加詳實準確的信息。通過分析化驗室藥廠室內新風凈化系統(tǒng)隨著使用時間的延長室內空氣中微生物群落結構的變化，發(fā)現該地區(qū)室內空氣中微生物含量較豐富，群落結構長期變化不大，并且空氣中存在條件致病菌，如奧斯陸莫拉氏菌等。該地區(qū)室內新風空氣凈化系統(tǒng)使用12 個月時存在一定的微生物二次污染風險。