楊思雨，趙雪純，王玉帥，丁 琪，王 秀

馬來酸噻嗎洛爾為一新型強效β受體阻斷藥，對β1和β2受體都有阻斷作用[1]，無膜穩(wěn)定作用，無內(nèi)源性擬交感活性，無直接抑制心臟作用，有明顯的降低眼壓作用。臨床用于治療高血壓病、心絞痛、心動過速、青光眼及嬰幼兒血管瘤的治療[2-3]。對輕、中度高血壓療效較好，無明顯不良反應(yīng)，可與利尿劑合用。心肌梗死病人長期用藥后能降低再次梗死發(fā)生率和死亡率。對青光眼，特別是原發(fā)性、開角型青光眼有良好的效果，優(yōu)于傳統(tǒng)的降眼壓藥[4]。其特點為起效快、不良反應(yīng)少、耐受性好，對瞳孔大小、對光反應(yīng)及視力均無影響。對某些繼發(fā)性青光眼、高眼壓病以及其他對藥物和手術(shù)無效的青光眼也有一定療效。但其水溶性過大，藥物吸收迅速，達不到持久效果。馬來酸噻嗎洛爾局部涂抹治療淺表血管瘤療效顯著，是表淺型局限性嬰幼兒血管瘤(面積較小)的首選用藥之一，目前國內(nèi)尚無商品化噻嗎洛爾外用制劑，市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液為水溶液制劑，使用不方便，敷藥后容易蒸發(fā)，劑量不容易掌握，長期使用會致皮膚干燥、脫皮[5]。因此，本實驗擬將其制成磷脂復(fù)合物，以提高馬來酸噻嗎洛爾的脂溶性，增加藥物的吸收與作用時間，提高生物利用度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 FA224型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱攪拌器(金壇市金南儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；紫外分光光度計(日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué))；DSC-60A型差示熱量掃描儀(日本島津公司)。

1.2 藥物與試劑 大豆磷脂[梯希愛(上海)化學(xué)工業(yè)發(fā)展有限公司]、馬來酸噻嗎洛爾(天津市中央藥業(yè)有限公司)，分析純四氫呋喃、三氯甲烷。

1.3 磷脂復(fù)合物中馬來酸噻嗎洛爾含量分析

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Welchrom-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(55∶45)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為298 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

1.3.2 標準曲線的制備 精密稱取馬來酸噻嗎洛爾標準品10.0 mg于50 mL容量瓶中，加雙蒸水溶解并定容至刻度線，即得200 μg/mL的儲備液。再將其依次稀釋成質(zhì)量濃度為5、12.5、25、50、100 μg/mL的溶液。均進樣20 μL，按1.3.1色譜條件測定峰面積。

1.3.3 精密度試驗 取12.5、25、50 μg/mL低、中、高3種濃度的標準溶液，在同一日內(nèi)按照2 h的時間間隔，進樣20 μL檢測，每個質(zhì)量濃度平行測定3次，按所測峰面積積分值，求取日內(nèi)相對標準差(RSD)，計算日內(nèi)精密度。同時，將該試驗樣品在第1天、第2天、第3天分別測定，計算日間精密度。

1.3.4 重復(fù)性試驗 配制12.5、25、50 μg/mL低、中、高3種濃度的馬來酸噻嗎洛爾水溶液各6份，取上述樣品過0.45 μm的微孔濾膜，按1.3.1色譜條件在同一日內(nèi)將6份續(xù)濾液依次連續(xù)進樣20 μL，測定其峰面積計算RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 取標準溶液適量，分別在0、2、4、6、12 h取續(xù)濾液20 μL，按1.3.1條色譜條件進樣分析，記錄峰面積以考察其穩(wěn)定性。

1.4 馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物制備與驗證

1.4.1 馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物制備 稱取一定量的馬來酸噻嗎洛爾與大豆磷脂在一定條件下復(fù)合一定時間后，減壓蒸去復(fù)合溶劑，再加入適量的三氯甲烷充分溶解，過濾，減壓旋蒸除去三氯甲烷，沉淀干燥，即得馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物。因為馬來酸噻嗎洛爾不溶于三氯甲烷而磷脂復(fù)合物易溶，因此m即為未復(fù)合的藥量。按下列公式[5-7]計算復(fù)合率(C):

式中：M為馬來酸噻嗎洛爾的初試投入質(zhì)量(g)；m為沉淀干燥后質(zhì)量(g)。

1.4.2 單因素試驗考察各因素對復(fù)合率的影響[5-7]

1.4.2.1 藥物與磷脂的投料比對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑、復(fù)合溫度40 ℃、復(fù)合時間3 h條件下，選擇藥物:大豆磷脂投料摩爾比1∶2、1∶2.5、1∶3進行單因素考察。

1.4.2.2 復(fù)合溫度對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑、物料比為1∶2.5、復(fù)合3 h條件下，選擇復(fù)合溫度30、40、50 ℃進行單因素考察。

1.4.2.3 復(fù)合時間對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑、物料比為1∶2.5、復(fù)合溫度40 ℃條件下，選擇復(fù)合時間為2、3、4 h進行單因素考察。

1.4.3 磷脂復(fù)合物的驗證

1.4.3.1 差示掃描量熱(DSC)分析 以Al2O3或鋁坩堝為參比，溫度范圍40～400 ℃，升溫速度5 ℃/min，N2既為保護氣又為吹掃氣[8]，分別取馬來酸噻嗎洛爾、大豆磷脂、馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物以及馬來酸噻嗎洛爾和大豆磷脂的混合物進行DSC[9]。

1.4.3.2 紫外光譜(UV)分析 分別取馬來酸噻嗎洛爾、大豆磷脂和馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物及大豆磷脂和馬來酸噻嗎洛爾混合物，用甲醇溶解，于波長200～400 nm進行掃描[10]。

1.4.3.3 紅外光譜(IR)分析 分別取馬來酸噻嗎洛爾、大豆磷脂、磷脂復(fù)合物及其物理混合物適量，用KBr壓片法于4 000～400 cm-1范圍進行紅外掃描[7]。

1.5 馬來酸噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物溶解性測定 取適量的馬來酸噻嗎洛爾、磷脂復(fù)合物及其混合物分別加入適量的H2O和乙醇中，磷脂復(fù)合物事先破乳處理，于室溫震蕩24 h[11-12]，得馬來酸噻嗎洛爾、磷脂復(fù)合物及物理混合物的過飽和溶液，以12 000 r/min離心8 min，按1.3.1項下條件測定上清液中馬來酸噻嗎洛爾的含量并計算其溶解度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察 以峰面積為縱坐標，以馬來酸噻嗎洛爾濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=23 531X+105 614，r=0.999 9，表明馬來酸噻嗎洛爾在5～100 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。日內(nèi)精密度、日間精密度、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗的RSD分別為：0.68%、1.26%、1.65%、0.95%。結(jié)果顯示該方法表現(xiàn)良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 物料比對噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑，40 ℃溫度下，復(fù)合3 h，藥物:大豆磷脂摩爾比為1∶2、1∶2.5、1∶3，復(fù)合率分別為(92.81±1.34)%、(93.00±0.92)%、(89.77±0.89)%。復(fù)合率在藥物:大豆磷脂摩爾比為1∶2.5時最大，故選用1∶2.5為復(fù)合的最佳物料比。

2.2.2 復(fù)合溫度對噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑、物料比為1∶2.5、復(fù)合3 h條件下，溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃的噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為(96.42±0.65)%、(96.67±0.34)%、(96.88±0.21)%?？梢姕囟葘?fù)合率的影響不大。綜合比較，選取40 ℃作為復(fù)合條件。

2.2.3 復(fù)合時間對噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響 以10 mL四氫呋喃為復(fù)合溶劑、物料比為1∶2.5、40 ℃條件下復(fù)合2、3、4 h，噻嗎洛爾磷脂復(fù)合物復(fù)合率分別為(91.3±1.03)%、(96.06±0.25)%、(93.5±0.76)%。復(fù)合時間為3 h的復(fù)合率最高，因此選擇3 h作為最佳復(fù)合時間。

2.3 DSC分析 馬來酸噻嗎洛爾在204 ℃左右有吸熱峰，大豆磷脂在350 ℃左右有不明顯吸熱峰，復(fù)合物中馬來酸噻嗎洛爾及大豆磷脂的特征峰消失，混合物在220 ℃左右有不明顯吸熱峰(見圖1)。

2.4 UV分析 馬來酸噻嗎洛爾在225 nm以及300 nm附近有吸收峰，磷脂在200～225 nm范圍內(nèi)有較大吸收，磷脂復(fù)合物與物理混合物紫外吸收圖譜相似，在225 nm及300 nm附近均有較強吸收(見圖2)。

2.5 IR分析 馬來酸噻嗎洛爾的OH吸收峰為3 428.81 cm-1；大豆磷脂的C=O吸收峰為1 731.76 cm-1，P=O吸收峰為1 461.7 cm-1；物理混合物的C=O吸收峰在1 727.9 cm-1，C-H的吸收峰在2 850.2 cm-1、2 910.0 cm-1處；磷脂復(fù)合物的OH吸收峰出現(xiàn)在3 369.03 cm-1處，而C=O吸收峰在1 739.4 cm-1處(見圖3)。

2.6 溶解度 馬來酸噻嗎洛爾在蒸餾水中的溶解度明顯大于其磷脂復(fù)合物，而在三氯甲烷中其磷脂復(fù)合物溶解度明顯提高(P<0.01)，約為馬來酸噻嗎洛爾的1.9倍。在三氯甲烷溶液內(nèi)，磷脂復(fù)合物溶解度最大，較馬來酸噻嗎洛爾單體及物理混合物均有明顯增加(P<0.01)(見表1)。

表1 各物質(zhì)在蒸餾水及三氯甲烷中的溶解度

3 討論

本實驗采用溶劑揮發(fā)法[13]制備磷脂復(fù)合物，所用溶劑須是非質(zhì)子傳遞溶劑，如乙酸乙酯、四氫呋喃、三氯甲烷、無水乙醇等。本實驗探討在四氫呋喃中的馬來酸噻嗎洛爾復(fù)合率。實驗以復(fù)合率為指標采用單因素試驗對物料比、復(fù)合溫度、復(fù)合時間進行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對復(fù)合率的影響較小，在實驗條件下選取3個溫度的復(fù)合率無明顯差異。對復(fù)合率影響較大的因素為馬來酸噻嗎洛爾與磷脂的投料比，其次為復(fù)合時間。在優(yōu)化條件下制得的復(fù)合物復(fù)合率可達(96.54±2.46)%。本實驗表明馬來酸噻嗎洛爾與磷脂間的復(fù)合較易進行，復(fù)合條件較易，這可能是因馬來酸噻嗎洛爾與磷脂間形成了氫鍵或分子間作用力[14-15]。

磷脂與藥物形成磷脂復(fù)合物后對藥物的親脂性和親水性均有改變作用，可增加藥物的胃腸道吸收以及藥物的透皮能力，因此磷脂復(fù)合物在藥劑學(xué)方面?zhèn)涫荜P(guān)注[16]。馬來酸噻嗎洛爾水溶性較強，將其開發(fā)成磷脂復(fù)合物可適當降低其水溶性增加脂溶性。DSC結(jié)果顯示馬來酸噻嗎洛爾在204 ℃左右有吸熱峰，大豆磷脂在350 ℃左右有不明顯吸熱峰，復(fù)合物中馬來酸噻嗎洛爾及大豆磷脂的特征峰消失，推測馬來酸噻嗎洛爾與大豆磷脂形成復(fù)合物過程中發(fā)生相互作用，熱力學(xué)性質(zhì)改變，而混合物在220 ℃左右有不明顯吸熱峰，可能馬來酸噻嗎洛吸收峰出現(xiàn)了位移。從UV及IR結(jié)果可知，復(fù)合物中的紫外吸收及紅外官能團較混合物均未改變，表明在復(fù)合過程中形成了分子鍵而未形成新的化合物。溶解度測定中，馬來酸噻嗎洛爾有較高水溶性，其混合物水溶性稍降低，而復(fù)合物在水溶液中幾乎不溶；相反在有機溶劑三氯甲烷中，馬來酸噻嗎洛爾溶解度最低，其物理混合物溶解度有所提高，馬來酸噻嗎洛爾制成磷脂復(fù)合物后在三氯甲烷中的溶解度明顯提高。物理混合物在蒸餾水及三氯甲烷內(nèi)溶解度較單體均有改變，可能磷脂與藥物產(chǎn)生了分子間作用力，但這種作用力較磷脂復(fù)合物弱，故對溶解度的影響較小。通常脂溶性高的藥物，其經(jīng)皮滲透性強，藥物透皮吸收增加[17-18]。后續(xù)研究中將對磷脂復(fù)合物的體內(nèi)外滲透性及體內(nèi)藥代動力學(xué)進行研究，為該復(fù)合物的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。