劉婷婷，劉麗，林文果，黃大崗

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見的引起心血管系統(tǒng)疾病的重要原因[1]。目前的研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞過度凋亡等可能是缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制[2]。缺氧復(fù)氧條件下，心肌細(xì)胞中積累大量的氧自由基，這些氧自由基可以引起細(xì)胞氧化損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。氧化苦參堿（OMT）具有廣泛的藥理作用，其主要來源于山豆根、苦參、苦豆子等植物，有明顯的抗氧化、抗病毒、殺菌、神經(jīng)功能保護(hù)、抗腫瘤等作用[3]。研究報(bào)道表明，氧化苦參堿具有保護(hù)心肌損傷的作用[4]。氧化苦參堿治療后的心肌缺血再灌注大鼠抗氧化酶SOD活性明顯升高[5]。氧化苦參堿還可以改善心肌缺血再灌注大鼠心肌脂質(zhì)過氧化[6]。NF-κB是一個(gè)在缺血再灌注損傷中過度激活的信號(hào)通路，抑制其激活可以減輕缺血再灌注損傷[7]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可降低外界有害刺激誘導(dǎo)的正常細(xì)胞中NF-κB的激活水平[8]。現(xiàn)階段對(duì)于氧化苦參堿對(duì)體外缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響還不清楚。本研究首先分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，構(gòu)建缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型，探討氧化苦參堿對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響，為氧化苦參堿治療缺血再灌注心肌損傷的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 出生3 d以內(nèi)的大鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（C-Caspase-3）抗體購自美國Abcam；乳酸脫氫酶（LDH）含量測(cè)定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；核因子-κBp65（NF-κBp65）抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒購自青島捷世康生物科技有限公司；超氧化物歧化酶 （SOD）活性測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測(cè)定試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司。

1.2 大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[9]，取出生3 d以內(nèi)的大鼠，經(jīng)過75%的酒精浸泡消毒以后，放在無菌操作臺(tái)中，開胸，將心包膜剝離，取出心室組織，以在4 ℃環(huán)境中預(yù)冷后的PBS將組織反復(fù)洗滌，剪碎后添加10倍體積的胰蛋白酶（濃度為0.1%），放在37 ℃條件下孵育消化10 min，混合均勻以后，放在室溫中靜止2 min，將上清溶液棄掉，然后繼續(xù)添加0.1%的胰蛋白酶消化液，放在37 ℃條件下孵育消化10 min，收集上清溶液，1000 g離心10 min，把上清溶液棄掉，添加10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)30 min以后，將細(xì)胞上清溶液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建及處理 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[10]，更換不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在37 ℃、95% N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h，然后放在37 ℃、95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)16 h，即為缺氧復(fù)氧模型。大鼠心肌細(xì)胞分成正常對(duì)照組（Normal組）、缺氧復(fù)氧組（H/R組）、OMT-L組、OMT-M組、OMT-H組。OMT-L組、OMT-M組、OMT-H組細(xì)胞分別在缺氧復(fù)氧處理前30 min加入氧化苦參堿，氧化苦參堿終濃度為15、30、60 μmol/L。Normal組細(xì)胞按照常規(guī)條件培養(yǎng)。H/R組在缺氧復(fù)氧處理前30 min加入0 μmol/L的氧化苦參堿，給予缺氧復(fù)氧處理。Normal組正常培養(yǎng)，不用氧化苦參堿和缺氧復(fù)氧處理。

1.4 噻唑藍(lán)（MTT）測(cè)定細(xì)胞活力 按照Normal、H/R、OMT-L、OMT-M、OMT-H組分組方法將細(xì)胞接種到96孔板，復(fù)氧處理以后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，然后在每個(gè)孔中添加10 μl的MTT溶液，放在37 ℃繼續(xù)孵育反應(yīng)4 h。將孔中的液體棄掉，加入150 μl的二甲基亞砜（DMSO）溶液，反應(yīng)10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的光密度值（OD值），以不含細(xì)胞的孔調(diào)零。OD值代表細(xì)胞增殖活力。

1.5 LDH、MDA、SOD、CAT水平檢測(cè) 收集Normal、H/R、OMT-L、OMT-M、OMT-H組細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞，分別用試劑盒檢測(cè)上清中LDH水平以及細(xì)胞中MDA、SOD、CAT水平，步驟完全按照LDH水平測(cè)定試劑盒、MDA含量測(cè)定試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒、CAT活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡 收集Normal、H/R、OMT-L、OMT-M、OMT-H組細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮在冰預(yù)冷以后的PBS緩沖液中，1000 g離心10 min。在細(xì)胞中添加結(jié)合緩沖液400 μl，充分混合以后，添加10 μl的碘化丙啶（PI）和5 μl的膜聯(lián)蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）工作液，放在避光條件下結(jié)合20 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡變化。

1.7 Western blot檢測(cè)C-Caspase-3、NFκBp65蛋白表達(dá) 收集Normal、H/R、OMT-L、OMT-M、OMT-H組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液洗滌3次，然后加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解試劑，吹打混合以后，在4 ℃條件下以12 000 g離心10 min，吸取上清溶液，用二喹啉甲酸（BCA）方法測(cè)定蛋白濃度。制備10%的分離膠，在每個(gè)孔中添加40 μg的蛋白樣品，蛋白在添加到上樣孔之前需要與等體積的Loading Buffer混合煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳采用100 V恒壓，肉眼觀察藍(lán)色的染料進(jìn)入到距離玻璃板的底部邊緣約1 cm時(shí)終止電泳。取出凝膠，將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪成合適大小，在冰上以200 mA的恒流轉(zhuǎn)膜1 h。取出PVDF膜，放在用TBST配制的5%牛血清白蛋白封閉液中，在搖床上水平晃動(dòng)孵育1 h。PVDF膜置于用封閉液配制的一抗反應(yīng)液中，在4 ℃條件下孵育過夜。最后將PVDF膜放在用封閉液按照1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗溶液中，在37 ℃孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑盒顯色以后，分析條帶的OD值，把甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，分析目的蛋白的表達(dá)水平。C-Caspase-3、NF-κBp65一抗按照1:800、1:600稀釋。

1.8 NF-κB激活劑對(duì)氧化苦參堿影響心肌細(xì)胞損傷功能檢測(cè) 取大鼠心肌細(xì)胞，在缺氧復(fù)氧前30 min同時(shí)添加1 mg/L的NF-κB激活劑脂多糖（LPS）和30 μmol/L的氧化苦參堿，記為OMTM+LPS組。以O(shè)MT-M組作為對(duì)照，用MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖（參照1.4），試劑盒測(cè)定LDH、MDA、SOD、CAT水平（參照1.5），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（參照1.6），Western blot檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、NF-κBp65蛋白表達(dá)（參照1.7）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均用軟件SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較用t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿減輕缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞損傷 H/R組大鼠心肌細(xì)胞活力降低，LDH水平和MDA水平升高，SOD和CAT活性下降，與Normal組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OMT-L、OMT-M、OMT-H組大鼠心肌細(xì)胞活力依次升高，LDH水平和MDA水平依次降低，SOD和CAT活性依次升高，與H/R組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），氧化苦參堿提高缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞活力，減輕大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷（圖1，表1）。

2.2 氧化苦參堿減少缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡H/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，與Normal組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OMT-L、OMT-M、OMT-H組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平依次降低，與H/R組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。氧化苦參堿減少缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡（圖1，表2）。

2.3 氧化苦參堿減少缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá) H/R組大鼠心肌細(xì)胞NFκBp65蛋白表達(dá)水平升高，與Normal組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OMT-L、OMT-M、OMT-H組大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白水平依次降低，與H/R組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），氧化苦參堿減少缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)（圖2，表3）。

2.4 NF-κB信號(hào)通路激活劑逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿抑制缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)的功能 與OMT-M組比較，OMT-M+LPS組大鼠心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NF-κB信號(hào)通路激活劑LPS逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿抑制氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)的功能（圖3，表4）。

2.5 NF-κB信號(hào)通路激活劑逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿抑制缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡功能 與OMT-M組比較，OMT-M+LPS組大鼠心肌細(xì)胞活力降低，LDH和MDA水平升高，SOD和CAT活性降低，凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。NF-κB信號(hào)通路激活劑LPS逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿抑制缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡功能（圖4，表5）。

3 討論

氧化苦參堿含有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)，其是從豆科槐屬中提取出來的生物堿，其有很多生物學(xué)作用，對(duì)于組織纖維化、脂肪肝、神經(jīng)損傷等均具有保護(hù)作用[3]。研究顯示，氧化苦參堿有心血管保護(hù)作用，其可以抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[11]。氧化苦參堿減輕大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷[5]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化苦參堿可以體外提高缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞活力，這與之前的研究結(jié)果一致，均提示氧化苦參堿可能具有改善缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷的作用。

缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是目前研究較多的機(jī)制之一[12]。缺氧復(fù)氧條件下，心肌細(xì)胞中的抗氧化酶活性降低，產(chǎn)生的氧自由不能及時(shí)降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞中氧自由基過度積累，這些氧自由基可以刺激細(xì)胞中的脂質(zhì)發(fā)生過氧化[13]。MDA大量的氧自由基不僅可以造成細(xì)胞氧化損傷，其還可以激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase凋亡反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。Caspase蛋白家族成員多以酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)，其只有被活化剪切后才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[18]。Caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)的下游執(zhí)行因子，其被活化后形成C-Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志[19]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH水平和MDA水平降低，SOD和CAT活性升高，細(xì)胞凋亡率減少，細(xì)胞中C-Caspase-3水平降低，提示氧化苦參堿可以減輕缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡。

表1 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力（OD值）和LDH、SOD、MDA、CAT水平（±s）

表1 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力（OD值）和LDH、SOD、MDA、CAT水平（±s）

注：Normal：正常對(duì)照組；H/R：缺氧復(fù)氧組；OMT-L：15μmol/L氧化苦參堿處理組；OMT-M：30 μmol/L氧化苦參堿處理；OMT-H：60 μmol/L氧化苦參堿處理組；OD；光密度值；LDH：乳酸脫氫酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；與Normal比較，aP＜0.05；與H/R比較，bP＜0.05；與OMT-L比較，cP＜0.05；與OMT-M比較，dP＜0.05

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圖1 氧化苦參堿對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡影響

表2 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平（±s）

表2 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平（±s）

注：Normal：正常對(duì)照組；H/R：缺氧復(fù)氧組；OMT-L：15 μmol/L氧化苦參堿處理組；OMT-M：30 μmol/L氧化苦參堿處理；OMT-H：60 μmol/L氧化苦參堿處理組；與Normal比較，aP＜0.05；與H/R比較，bP＜0.05；與OMT-L比較，cP＜0.05；與OMT-M比較，dP＜0.05

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圖2 Western blot檢測(cè)NF-κBp65蛋白表達(dá)

表3 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（±s）

表3 氧化苦參堿處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（±s）

注：Normal：正常對(duì)照組；H/R：缺氧復(fù)氧組；OMT-L：15 μmol/L氧化苦參堿處理組；OMT-M：30 μmol/L氧化苦參堿處理；OMT-H：60 μmol/L氧化苦參堿處理組；與Normal比較，aP＜0.05；與H/R比較，bP＜0.05；與OMT-L比較，cP＜0.05；與OMT-M比較，dP＜0.05

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圖3 Western blot檢測(cè)LPS和氧化苦參堿對(duì)心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)影響

是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物[14]。脂質(zhì)是細(xì)胞膜的重要組成部分，其發(fā)生過氧化后可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致原本存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH進(jìn)入細(xì)胞外[15]。SOD和CAT是存在于機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，其活性的高低與細(xì)胞內(nèi)的氧自由基密切相關(guān)[16]。

表4 氧化苦參堿和LPS處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（±s）

表4 氧化苦參堿和LPS處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（±s）

注：OMT-M：30 μmol/L氧化苦參堿處理；OMT-M+LPS：在缺氧復(fù)氧前30 min同時(shí)添加1 mg/L的NF-κB激活劑LPS和30 μmol/L的氧化苦參堿組

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圖4 氧化苦參堿和LPS對(duì)缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞凋亡和C-Caspase-3蛋白水平影響

表5 氧化苦參堿和LPS處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞活力（OD值）和LDH、SOD、MDA、CAT水平以及凋亡率、C-Caspase-3蛋白水平比較（±s）

表5 氧化苦參堿和LPS處理后的缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞活力（OD值）和LDH、SOD、MDA、CAT水平以及凋亡率、C-Caspase-3蛋白水平比較（±s）

注：OMT-M：30 μmol/L氧化苦參堿處理；OMT-M+LPS：在缺氧復(fù)氧前30 min同時(shí)添加1 mg/L的NF-κB激活劑LPS和30 μmol/L的氧化苦參堿組；OD值：光密度值；LDH：乳酸脫氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；CAT：過氧化氫酶；C-Caspase-3：剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3；與OMT-M比較，aP＜0.05

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NF-κB是一個(gè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，其可同B細(xì)胞的免疫球蛋白的κB序列結(jié)合，其可調(diào)控很多基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、免疫激活、病毒復(fù)制等過程中發(fā)揮作用[20]。NF-κB家族成員含有多個(gè)，在哺乳動(dòng)物中NF-κB p65是NF-κB行使功能的關(guān)鍵亞單位。NF-κB信號(hào)在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中過度活化，抑制其激活可以減輕心肌細(xì)胞損傷[21]。氧化苦參堿的作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，其可以通過抑制NF-κB信號(hào)激活減輕外界有害刺激誘導(dǎo)的正常細(xì)胞損傷[8,22]。本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化苦參堿可以降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活程度，并且NF-κB信號(hào)通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響，提示氧化苦參堿作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)有關(guān)。

綜上，氧化苦參堿可以通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的激活水平減輕缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷，減少細(xì)胞凋亡。這為研究氧化苦參堿在缺血再灌注心肌損傷中的作用提供了參考，為臨床上氧化苦參堿治療缺血再灌注心肌損傷提供了理論依據(jù)。