權(quán)浩浩，程小紅，杜 霞，張曉鳳△

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)；3.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003 )

近年來，慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷升高。2012年的研究顯示，我國(guó)CKD發(fā)病率為10.8%[1]，這一數(shù)字說明CKD已經(jīng)成為我國(guó)一個(gè)嚴(yán)峻的健康問題，給患者家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路[2]，其主要特征是成纖維細(xì)胞的過度積累與細(xì)胞外基質(zhì)沉積[3]。多項(xiàng)研究表明，延緩CKD患者RIF進(jìn)展對(duì)保護(hù)患者殘余腎功能，延緩腎功能惡化具有重要意義[4]。但RIF是一個(gè)龐雜的動(dòng)態(tài)過程，目前缺乏特異性的防治措施，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、TGF-β拮抗劑/阻滯劑為主要治療手段，但治療效果不佳。中醫(yī)藥具有辨證論治、個(gè)體診療的鮮明特點(diǎn)，中藥具有多靶點(diǎn)、靶點(diǎn)協(xié)同的干預(yù)效果。陜西省中醫(yī)醫(yī)院程小紅[5]教授將宏觀辨證與腎臟病理微觀辨證相結(jié)合，創(chuàng)制益腎散結(jié)復(fù)方腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF。該方由山萸肉、菟絲子、熟地黃、金櫻子、淫羊藿、丹參、赤芍、姜黃、黃芪、山藥、王不留行、鱉甲(醋)等12味中藥組成。臨床應(yīng)用多年，療效較好。但中藥復(fù)方具有藥味多、成分復(fù)雜的特點(diǎn)，因此我們對(duì)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不清楚。

整合藥理學(xué)( Integrative pharmacology，IP) 是研究多成分藥物與機(jī)體相互作用及其整合規(guī)律和作用原理的一門學(xué)科[6]。強(qiáng)調(diào)“整體與局部”“體內(nèi)與體外”“體內(nèi)過程與活性評(píng)價(jià)”等多層次、多環(huán)節(jié)的整合研究[7-9]。與中醫(yī)藥的“整體觀”“辨證論治”“方劑用藥”的特點(diǎn)不謀而合。本文以整合藥理學(xué)研究策略為手段，深入研究腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的作用靶點(diǎn)，明確其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立 基于整合藥理學(xué)平臺(tái)V2.0的中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)依次檢索腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊中對(duì)應(yīng)藥材,收集藥物相似性得分(Drug-likeness weight)高于0.8的成分信息并依次編號(hào)，構(gòu)建腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊的原始化學(xué)成分庫(kù)。腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊中的藥材鱉甲為鱉科動(dòng)物鱉(Trionyx sinensis wiegmann)的干燥背甲,具有滋陰潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)、退熱除蒸之功效。鱉甲的主要化學(xué)成分為氨基酸、多糖、微量元素，具有免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤、抗肝纖維化等藥理活性[10]。因其作為動(dòng)物藥材的特殊之處，加之整合藥理學(xué)平臺(tái)未收錄，故暫不將其納入研究。

2 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè) 整合藥理學(xué)平臺(tái)(TCMIP V2.0)以ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，該平臺(tái)具有中藥(含方劑)靶標(biāo)預(yù)測(cè)和功能分析的強(qiáng)大功能。靶標(biāo)預(yù)測(cè)原理是基于開源軟件Open Babel提取藥物化學(xué)成分MACCS分子指紋信息，并將化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)信息與FDA批準(zhǔn)上市藥物進(jìn)行化學(xué)指紋特征對(duì)比，以谷本系數(shù)(Tanimoto coefficient)定義的相似度計(jì)量方法進(jìn)行相似性打分。本研究選取相似性打分值≥0.8的靶標(biāo)為成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶標(biāo)，并以此作為化合物候選靶標(biāo)。最后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶標(biāo)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，轉(zhuǎn)化為基因名稱，以便后續(xù)研究參考應(yīng)用。

3 RIF相關(guān)基因收集 以“Renal interstitial fibrosis”作為檢索詞分別在疾病相關(guān)基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Dis Ge NET)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(ETCM)及基因名片數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Cards)檢索、收集RIF相關(guān)基因，最后整合3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的基因信息，進(jìn)行去重復(fù)值處理，建立RIF相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 靶標(biāo)映射 將預(yù)測(cè)得到的化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)與RIF相關(guān)基因分別整理成Excle文件，導(dǎo)入Venn diagram進(jìn)行靶標(biāo)映射、取交集處理。

5 通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)強(qiáng)大的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。我們將靶標(biāo)映射后得到的藥物和疾病共有靶標(biāo)結(jié)果整理、導(dǎo)入DAVID 6.8，選擇“office gene symbol”，物種設(shè)置為“Homo sapiens”,基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的P<0.01、FDR<0.01，選取靶點(diǎn)數(shù)量較多的前20條通路來構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)。

6 “方劑-藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于上述所獲得的腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊的藥材、成分、靶點(diǎn)、通路信息，采用Cytoscape軟件3.6.1構(gòu)建“方劑-藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)，并利用自帶插件Network analyzer進(jìn)行分析。以文獻(xiàn)中常用的度、介數(shù)中心度(Betweenness centrality)、緊密中心度(Close centrality)均大于平均值為依據(jù)對(duì)關(guān)鍵化合物及靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而預(yù)測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制。

結(jié) 果

1 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成 基于整合藥理學(xué)平臺(tái)(TCMIP V2.0)共收集了腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊中11味藥材對(duì)應(yīng)219個(gè)化合物。其中山茱萸32個(gè)、菟絲子5個(gè)、熟地黃9個(gè)、金櫻子14個(gè)、淫羊藿17個(gè)、丹參37個(gè)、赤芍16個(gè)、姜黃12個(gè)、黃芪24個(gè)、山藥35個(gè)、王不留行18個(gè)，進(jìn)行去重復(fù)處理后得到198個(gè)化合物。

2 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè) 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊中對(duì)應(yīng)198個(gè)化學(xué)成分，共預(yù)測(cè)得到6030個(gè)靶標(biāo)，進(jìn)行去重復(fù)值后得到1011個(gè)靶標(biāo)，以此作為腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊的藥物候選靶標(biāo)。

3 RIF相關(guān)基因收集 通過檢索Dis Ge NET、ETCM和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到33個(gè)、14個(gè)、2107個(gè)RIF相關(guān)基因，整合檢索結(jié)果共得到2154個(gè)基因。剔除重復(fù)后，得到2117個(gè)RIF相關(guān)基因。

4 靶標(biāo)映射 將得到的1011個(gè)藥物候選靶標(biāo)與2117個(gè)RIF相關(guān)基因進(jìn)行靶標(biāo)映射，得到226個(gè)藥物及疾病共有靶標(biāo)。認(rèn)為這226個(gè)靶點(diǎn)可能是腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的直接作用靶點(diǎn)。

5 通路富集 KEGG通路富集結(jié)果顯示，226個(gè)藥物及疾病共有靶標(biāo)共富集在138條通路上。根據(jù)P<0.01、FDR<0.01，確定了20條重要通路(圖1)，并以這20條通路為基礎(chǔ)來構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)。

圖1 KEGG通路富集結(jié)果圖

6 “方劑-藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 根據(jù)方劑、藥材、成分、靶點(diǎn)、通路信息構(gòu)建腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)有456個(gè)節(jié)點(diǎn)，紅色四邊形節(jié)點(diǎn)代表腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊，菱形節(jié)點(diǎn)表示藥材有11味，三角形節(jié)點(diǎn)表示疾病和藥物共同有化合物198個(gè)，圓形節(jié)點(diǎn)表示疾病和藥物共同靶標(biāo)有226個(gè)，矩形節(jié)點(diǎn)表示關(guān)鍵通路有20條。邊有1822條，代表各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，表示藥材和化合物或化合物和靶標(biāo)，或靶標(biāo)與通路之間的聯(lián)系。借助Cytoscape軟件中的“Network analyzer”插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以度、介數(shù)中心度、緊密中心度均大于平均值為依據(jù)對(duì)關(guān)鍵化合物及靶點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，得到37個(gè)關(guān)鍵成分，36個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，選取度值較高的部分節(jié)點(diǎn)進(jìn)行展示，見表1、2。SFK043(Adenosine，腺苷)、SFK005(Palmitic Acid，棕櫚酸)、SFK017(Ursolic Acid，熊果酸)、SFK075(Oleanolic Acid，齊墩果酸)、SFK059(Stearic Acid，硬脂酸)、SFK033(Quercetin，槲皮素)、SFK034(Kaempferol，山奈酚)、SFK002(Linoleic Acid，亞油酸)、SFK090(Baicalin，黃芩苷)、SFK058(Linolenic Acid，亞麻酸)、SFK081(3-O-Acetyloleanolic Acid，3-O-乙酰齊墩果酸)、SFK061(Kaempferitrin,山柰甙)等12個(gè)化合物自由度均大于20。雄激素受體(Androgen receptor，AR)、糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，NR3C1)、核因子NF-κB p105亞基(Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit，NFKB1)、芳烴受體(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)、維生素D3受體(Vitamin D3receptor，VDR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等7個(gè)靶標(biāo)的自由度值均大于30。我們認(rèn)為這些度值較高的化合物可能是腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的主要藥效成分，度值較高的靶標(biāo)可能是腎復(fù)康Ⅱ號(hào)治療RIF的重要靶標(biāo)。另外，網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)單味中藥可對(duì)應(yīng)多個(gè)化合物，同一化合物可與多個(gè)靶標(biāo)具有相互作用關(guān)系，同一靶標(biāo)可富集于不同的信號(hào)通路上，這一現(xiàn)象說明了中藥治療疾病"多成分、多靶標(biāo)、多通路、靶點(diǎn)協(xié)同"的作用特點(diǎn)。

圖2 “腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊-藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊主要活性化合物信息

表2 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊關(guān)鍵靶標(biāo)信息

討 論

腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊以益腎散結(jié)為組方原則，切實(shí)符合RIF“腎虛血瘀”的核心病機(jī)。方中淫羊藿、菟絲子、金櫻子、熟地黃、山萸肉、山藥、黃芪同用，共奏溫補(bǔ)腎陽，助陽化氣之效；配伍丹參、赤芍、姜黃、王不留行、鱉甲(醋)，消瘀化痰散結(jié)；標(biāo)本兼顧，扶助正氣，祛除瘀血積滯，共奏益腎活血之效。

通過構(gòu)建益腎散結(jié)復(fù)方腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊 “藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”的多維網(wǎng)絡(luò)后發(fā)現(xiàn)，SFK043、SFK005、SFK017、SFK033、SFK034等化合物自由度最高。且存在不同藥材對(duì)應(yīng)同一種成分，一個(gè)靶標(biāo)對(duì)應(yīng)多個(gè)化合物的情況。我們認(rèn)為上述成分可能是該復(fù)方的主要藥效成分，相關(guān)研究也表明上述成分可通過不同機(jī)制干預(yù)RIF。其中腺苷可激活A(yù)1受體，通過抑制腎臟炎性因子表達(dá)、腎髓過氧化物酶激活等途徑干預(yù)RIF的進(jìn)程[11]。熊果酸與齊墩果酸是一對(duì)同分異構(gòu)體，屬五環(huán)三萜類化合物，具有抗糖尿病、抗炎及變態(tài)反應(yīng)、調(diào)脂抗肥胖等作用[12-14]。TGF-β1是經(jīng)典的促纖維化因子，過度表達(dá)可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚。而文獻(xiàn)報(bào)道熊果酸含藥血清可通過下調(diào) TGF-β1表達(dá)，抑制炎癥狀態(tài)下系膜細(xì)胞增殖[15]。槲皮素、山奈酚屬于黃酮類化合物，其中槲皮素能夠通過抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的積聚[16]，可顯著抑制系膜細(xì)胞增殖，使系膜細(xì)胞維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[17]。山奈酚可緩解高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎組織病理性損傷,抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[18]。

在“方劑-藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中自由度較高的靶點(diǎn)有AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等。其中雄激素受體屬于核受體超家族成員，與雄激素結(jié)合后參與血壓、血糖、血脂及人體內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)[19]。腎小管間質(zhì)纖維化程度是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷疾病預(yù)后的最重要指標(biāo)，炎癥是其主要的發(fā)病機(jī)制[20]。TNF-α是浸潤(rùn)細(xì)胞產(chǎn)生的重要的促炎因子，可以刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，招募炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化或凋亡[21]。糖皮質(zhì)激素受體,是配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化因子，有α、β兩種亞型，而糖皮質(zhì)激素主要與α結(jié)合發(fā)揮抗炎、抑制免疫炎癥等作用。NF-κB是由轉(zhuǎn)錄因子p65與轉(zhuǎn)錄因子p50構(gòu)成的二聚體蛋白，是調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，具有“開關(guān)效應(yīng)”。在正常腎小球細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，在異常活化狀態(tài)下，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖1顯示富集靶點(diǎn)數(shù)量最多的是PI3K-Akt信號(hào)通路。該通路是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑，也是調(diào)控、維持血糖平衡的主要信號(hào)通路。HIF-1信號(hào)通路與缺氧、貧血、炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 cAMP信號(hào)通路，稱為第二信使，是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信息傳遞通路，對(duì)于胞外信息具有迅速傳遞和信號(hào)放大的特點(diǎn)。

綜上，本研究整合藥理學(xué)研究策略與方法，挖掘到復(fù)方中11味藥材中198個(gè)成分及1011個(gè)靶標(biāo)，2117個(gè)疾病相關(guān)基因，得到226個(gè)共有靶標(biāo)，并行KEGG通路富集，最后通過構(gòu)建、分析“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。初步預(yù)測(cè)到腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊可能通過調(diào)節(jié)AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等。通過干預(yù)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血壓、血糖和血脂發(fā)揮對(duì)于RIF的治療作用。