黃 鋼,馬善波,楊雙武,高海鋒

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710032)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科(西安 710032)；3.西北大學(xué)附屬醫(yī)院(西安市第三醫(yī)院)(西安 710018)

腦卒中是由于血管阻塞或供血血管突然破裂導(dǎo)致血液無法流入腦組織造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病[1]。2018年，《中國腦卒中防治報(bào)告》顯示腦卒中已成為我國成人第一死亡原因，也是成人殘疾的首要原因[2]。中醫(yī)中藥對卒中治療具有悠久的歷史，積淀了深厚的理論基礎(chǔ)。中醫(yī)認(rèn)為腦卒中病變核心是氣血逆行上亂，主要病機(jī)是痰瘀阻滯腦絡(luò)，痰瘀郁久化熱產(chǎn)生各種毒性物質(zhì)。病因多為飲食不節(jié)、情志失調(diào)、正氣不足及勞倦過度等。病性為本虛標(biāo)實(shí)、上盛下虛，其中肝腎陰虛、氣血衰少為本，肝陽上亢、風(fēng)火相煽、瘀血阻滯、痰濕雍盛為標(biāo)。鵝不食草是一種雙子葉菊科植物石胡荽的全草，中醫(yī)記載具有祛風(fēng)通絡(luò)、解毒消腫之功效?！侗静菥V目》評論鵝不食草上達(dá)頭腦而治頂痛目病，內(nèi)達(dá)肺經(jīng)而治痰瘧、散瘡腫[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明鵝不食草不僅具有抑菌、抗炎、抗氧化作用，而且具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[4]，是一個(gè)極具研究價(jià)值和開發(fā)潛力的植物藥。但鵝不食草在腦缺血再灌注后抗炎抗氧化作用的研究較少。因此，本研究旨于建立腦缺血再灌注模型，探究鵝不食草對大鼠腦組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：72只7周齡雄性SD大鼠，SPF級，體重190～210 g，購自于并飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃、濕度50 %～60%、自由飲水?dāng)z食、12 h/12h晝夜節(jié)律、4只/籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑：中動(dòng)脈阻塞線栓(廣州佳靈生物科技公司)；鵝不食草醇提物(西安銳禾生物公司)；2,3,5-三苯基氯化銨(2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride,TTC)染料(武漢塞維爾生物公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione r-glutamyl cysteingl glycine,GSH)試劑盒、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)試劑盒、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor -α,TNF-α)試劑盒、白介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)試劑盒、白介素6(Interleukin,IL-6)試劑盒(南京建成生物功能研究所)；核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factors 2,Nrf2)抗體、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)抗體、核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)抗體、β-actin抗體(美國Proteintech公司)；RT-PCR試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型的建立與分組：將72只SD大鼠按隨機(jī)原則分為假手術(shù)組、腦缺血組、依達(dá)拉奉組(5 mg/kg)、鵝不食草100、200、400 mg/kg劑量組，每組12只。除假手術(shù)組外，各組按參考文獻(xiàn)[5]中方法制備腦缺血/再灌注模型。大鼠應(yīng)用400 mg/kg劑量水合氯醛完全麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部剪毛消毒。打開頸部皮膚，鈍性分離出頸總動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈、暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。自頸外動(dòng)脈開口，插入線栓，前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，以端點(diǎn)距離分叉處15 mm為終點(diǎn)。假手術(shù)組僅打開頸動(dòng)脈不做插線處理。

2.2 給藥方法：術(shù)前稀釋鵝不食草提取物，濃度分別為40 mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml。各組術(shù)前2 h，鵝不食草灌胃給藥，按大鼠體重，每100 mg給藥1 ml。依達(dá)拉奉腹腔給藥，劑量5 mg/kg。術(shù)后持續(xù)給藥，1次/d，給藥3 d后檢測各指標(biāo)。

3 檢測指標(biāo)

3.1 神經(jīng)功能評分：參考文獻(xiàn)[6]采用18分量表法評估大鼠神經(jīng)功能，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：觀察5 min內(nèi)大鼠在籠中自發(fā)運(yùn)動(dòng)(0～3分)；身體懸空，觀察四肢伸展情況(0～3分)；后肢懸空，前肢在鼠籠上爬行，僅靠前肢行走，觀察前爪伸展運(yùn)動(dòng)(0～3分)；觀察大鼠攀爬能力(1～3分)；觀察大鼠身體觸覺反射(1～3分)；觀察大鼠觸須觸覺反射(1～3分)。得分3～18分范圍內(nèi)。

3.2 模型大鼠腦梗死面積：水合氯醛深度麻醉大鼠，迅速斷頭取出腦組織，-80 ℃冷凍2 min后，連續(xù)切成6個(gè)冠狀切片，在2 %的TTC溶液中避光孵育15 min，將腦組織轉(zhuǎn)移到4 %多聚甲醛中固定，按順序展開并拍照。TTC染色后梗死區(qū)域呈白色，未梗死區(qū)域呈紅色。梗死面積占比=(梗死面積/該切片面積)×100%。

3.3 RT-PCR檢測大鼠腦組織Nrf2/HO-1和NF-κB的mRNA表達(dá)：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測Nrf2、HO-1、NF-κB p65表達(dá)。取大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)組織，液氮研磨，試劑盒提取總RNA。加入RT液、AWM逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物加入PCR液及上下游蛋白引物。反應(yīng)液置于熒光定量PCR上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件：95 ℃、15 s；92 ℃、10 s；72 ℃、75 s；60 ℃、15 s；35 個(gè)循環(huán)；54 ℃、10 min。校正每個(gè)待檢測樣本的Ct值，計(jì)算△Ct，2-△△Ct即為目的基因的表達(dá)。目的基因引物序列：Nrf2：上游引物5’-ACGTAGATCGATATAGCTATGGGATCAGT-3’，下游引物5’-CTGATAGCTAGATATTCAGTATAGCTA-3’；HO-1：上游引物5’-ACGCTAGATATTTAGATAGATCGAT-3’，下游引物5’-ACGCTA-GATATGTTAGACTAGATCGAT-3’；NF-κB：上游引物5’-CAUGCCAGUGAGAAUGUAUGCCAU-3’，下游引物5’-ACGCAGGAGACGGAAGAAUAAAU-3’；β-actin：上游引物5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，下游引物5’-CCACAGGATTCCATACCCAA-3’。

3.4 Western blot 檢測大鼠腦組織Nrf2/HO-1和NF-κB p65蛋白的表達(dá)：取大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)組織，加入RIPA裂解液后靜置10 min，4 ℃條件下研磨呈漿狀，離心后使用BCA試劑盒測試蛋白濃度，加入Loading buff，煮沸后等量上樣。電泳90 min后濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗稀釋液4 ℃過夜。PBS洗膜3次，加入二抗稀釋液，室溫孵育2 h，洗膜并加入超敏發(fā)光液，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測Nrf2、HO-1和NF-κB p65蛋白表達(dá)。

3.5 檢測大鼠腦組織中氧化因子、炎癥因子含量：取大鼠缺血側(cè)皮層組織，加入PBS溶液研磨，離心取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書添加樣品、試劑，孵育抗體后酶標(biāo)儀掃描波長。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組大鼠腦組織中氧化因子、炎癥因子含量。

結(jié) 果

1 鵝不食草對腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能評分的影響 假手術(shù)組未進(jìn)行造模處理，所有大鼠評分均為滿分18分；與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠神經(jīng)功能評分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示腦缺血模型造模成功；與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉治療介導(dǎo)大鼠神經(jīng)功能評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與腦缺血組相比，鵝不食草200 mg/kg劑量組和400 mg/kg劑量組升高了大鼠的神經(jīng)功能評分(圖1)。

a：與假手術(shù)組比較，P<0.05；b：與腦缺血組比較，P<0.05

2 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦梗死面積的影響 假手術(shù)組因?yàn)闆]有進(jìn)行插線栓處理，所以沒有出現(xiàn)梗死區(qū)域。與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦組織中出現(xiàn)顯著增加的梗死區(qū)域，量化統(tǒng)計(jì)達(dá)到了40%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組與鵝不食草200 mg/kg與400 mg/kg組大鼠腦梗死面積均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1(圖2)。

表1 各組大鼠腦組織中梗死面積占比比較(%)

圖2 各組大鼠腦組織中梗死面積

3 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 腦缺血組大鼠腦中抗氧化因子SOD、GSH水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腦缺血組氧化因子MDA、ROS表達(dá)均升高，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組、鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均顯著增加了大鼠腦中抗氧化因子SOD、GSH表達(dá)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而氧化因子MDA、ROS的含量顯著降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織中抗氧化因子和氧化因子水平比較

4 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組與鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組都顯著降低了腦缺血大鼠缺血半側(cè)腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

5 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA及NF-κB mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著升高了Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，腦缺血造成大鼠腦組織中NF-κB mRNA表達(dá)顯著升高，與腦缺血相比，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組降低了NF-κB mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組大鼠腦組織中炎癥因子水平比較(pg/mg)

表4 各組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA、HO-1mRNA及NF-κB mRNA表達(dá)比較

6 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦中Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均升高了Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，腦缺血造成大鼠腦組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均降低了p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5(圖3)。

表5 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)

討 論

腦卒中是一種臨床常見性疾病，具有較高的致殘和致死率。中醫(yī)將腦卒中歸于“中風(fēng)”的范疇，總病機(jī)屬于陰陽失調(diào)，氣血逆亂[7]。易水學(xué)派認(rèn)為：“凡人年逾四旬，氣衰之際，因憂喜憤怒傷其氣者，多有此疾”，即正氣不足是中風(fēng)的重要病因[8]。至清代王清任總結(jié)中醫(yī)中風(fēng)理論首創(chuàng)“氣虛血瘀”之理論，即氣血逆行，痰瘀郁滯所致瘀痰熱毒是造成中風(fēng)的關(guān)鍵[9]。因此，清熱解毒，化瘀通絡(luò)是中風(fēng)治療的重要方向。鵝不食草在中醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛，《本草匯言》中記載，其味辛烈，其氣辛熏，其性升散，能通肺經(jīng)，上達(dá)頭腦，故有祛痰通氣、散寒祛邪之功效。其去目翳障，并頭中寒邪、頭風(fēng)腦痛疾，皆取辛溫升散之功也。故本研究采用鵝不食草作為缺血性腦卒中治療藥物。

現(xiàn)代研究認(rèn)為腦卒中往往與腦組織中氧化/還原因子調(diào)節(jié)失衡相關(guān)。Nrf2/HO-1信號通路是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要機(jī)制。Cen等[10]研究顯示腦梗死缺血區(qū)皮質(zhì)中Nrf2和HO-1等蛋白表達(dá)量在24 h明顯上升。Nrf2在機(jī)體中扮演著氧化應(yīng)激反應(yīng)感受器的角色。HO-1是Nrf2下游蛋白，是一種抗氧化酶，在抗氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)清除氧自由基片段方面發(fā)揮作用。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞中Nrf2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過與Kelch 樣環(huán)氧氮氯丙烷相關(guān)蛋白(Kelch-like ech associating protein,Keap1)連接形成Nrf2-Keap1復(fù)合物，保持著無活性狀態(tài)且極易發(fā)生降解。當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增加時(shí)，Keap1-Nrf2復(fù)合物通過Keap1巰基修飾和Nrf2磷酸化方式，使其各自構(gòu)象發(fā)生變化，從而使Nrf2與Keap1發(fā)生解離，且Nrf2移位進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)抗氧化應(yīng)激原件結(jié)合[11]，激活抗氧化酶HO-1的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化作用，減少神經(jīng)元損傷或死亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[12]。馬行凱等[13]研究顯示小鼠腦缺血模型中Nrf2的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，缺血區(qū)Nrf2在再灌注2 h后表達(dá)增加，且在8 h時(shí)達(dá)到頂峰，而在24 h和72 h后開始減少，最終與假手術(shù)組無異。然而，也有與此不同的研究結(jié)果，肖宇等[14]研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注24 h時(shí)，Nrf2與HO-1表達(dá)量顯著上升。本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注72 h后，腦缺血組Nrf2 mRNA與蛋白表達(dá)與假手術(shù)組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與馬行凱等的研究一致。此外，與腦缺血組相比，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組則顯著增加了大鼠腦組織中Nrf2與HO-1 mRNA和蛋白含量表達(dá)。氧化應(yīng)激試劑盒檢測顯示，依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著增加了大鼠腦組織中抗氧化因子水平，減少了腦組織中氧化因子水平，說明依達(dá)拉奉與鵝不食草通過Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠腦組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)。

腦缺血引起的氧化損傷還可以繼續(xù)激活腦組織中炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放。與Nrf2相似，NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，受Keap1介導(dǎo)的IκB激酶β(IκB kinases β,IKKβ)調(diào)控。生理?xiàng)l件下，Keap1與NF-κB形成復(fù)合物，維持無活性狀態(tài)且易降解。當(dāng)Nrf2信號缺失會導(dǎo)致NF-κB p65與抑制因子IKKβ快速磷酸化，復(fù)合物被水解分離[15]。胞漿內(nèi)NF-κB p65移位進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮基因調(diào)控作用，促進(jìn)下游TNF-α、IL-1β和IL-6等大量炎性細(xì)胞因子分泌。有研究應(yīng)用siRNA敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞keap1基因，誘導(dǎo)Nrf2依賴的抗氧化酶表達(dá)增加，減少ROS在細(xì)胞內(nèi)的積累，而ROS則是NF-κB活化必不可少的[16]。本研究中，與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦中p-NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，介導(dǎo)腦中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌增加，而依達(dá)拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著減少了大鼠腦中p-NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)，顯著減少炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。