趙 茜，吳佳麗，余文麗，魏丹霞

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(昆明 650011)；2.昆明市中醫(yī)醫(yī)院(昆明 650011)

支氣管哮喘在中醫(yī)屬“哮病”范疇[1]，近年來(lái)哮喘患病率在全球范圍內(nèi)有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，2019年一項(xiàng)調(diào)查顯示，目前我國(guó)成人哮喘患者總數(shù)已達(dá)到4570萬(wàn)[2]。中醫(yī)認(rèn)為哮病的發(fā)生是由于宿痰伏肺，若誘因或感邪引觸致痰阻氣道，肺失肅降、痰氣搏結(jié)便產(chǎn)生發(fā)作性痰鳴氣喘疾患。既然引起哮病的根本原因是宿痰，那么運(yùn)用培土生金以“潤(rùn)養(yǎng)”、通調(diào)津氣以“通利”[3]不失為治療哮病的方法，“清熱潤(rùn)燥口服液”[4]是名中醫(yī)陸家龍老師的經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)現(xiàn)代工藝制備而成，其作用機(jī)理是通過(guò)增加肺組織或者氣道的水液生成，以“潤(rùn)”養(yǎng)氣道，通過(guò)減少氣道病理性黏液分泌，以“通利”氣道、促痰液排出來(lái)治療哮喘。本實(shí)驗(yàn)基于以上理論，通過(guò)觀察該藥對(duì)哮喘模型小鼠的氣道炎癥以及慢性氣道炎癥中最主要的黏蛋白5AC(Mucin 5AC，MUC5AC)，以及肺組織中影響氣道水液代謝的水通道蛋白5(Aquaporin 5，AQP5)的影響，并根據(jù)結(jié)果探討基于“潤(rùn)養(yǎng)與通利”理論，治療哮喘的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：72只6～8周齡BALB/c小鼠，平均體重(20±2)g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供[許可證號(hào)：SCXK(滇)k2015-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：清熱潤(rùn)燥口服液由桑葉、浙貝母、麥冬、茯苓、半夏各200 g，苦杏仁120 g，炒谷芽、炒麥芽、蘆根、薏苡仁、冬瓜仁各300 g，陳皮60 g，南沙參240 g組成。委托云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室制備提供，4.1 g原生藥/ml。藥物保存于4～8 ℃冰箱中備用，使用前復(fù)溫至20～25 ℃使用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立：每組12只小鼠，除對(duì)照組外，各組小鼠于第1、8、15 天腹腔注射OVA致敏液0.2 ml(含0.2 mg OVA和1 mg氫氧化鋁)。于第21 天起，將小鼠置于透明容器內(nèi)，給予2% OVA的生理鹽水霧化激發(fā)，1次/d，30 min/次，連續(xù)7 d；正常組采用生理鹽水代替OVA進(jìn)行處理。模型組造模后死亡2只，清熱潤(rùn)燥低劑量組死亡1只。

2.2 動(dòng)物分組及給藥：72只6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(地塞米松)及清熱潤(rùn)燥高、中、低劑量組，每組12只小鼠雌、雄各半。每組給藥劑量的依據(jù)：根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正常組與模型組于每日OVA霧化攻擊前1天，按照給藥劑量同體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃，清熱潤(rùn)燥高劑量組在造模成功后以8.64 g/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃，清熱潤(rùn)燥中劑量組在造模成功后以4.32 g/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃，清熱潤(rùn)燥低劑量組在造模成功后以2.16 g/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃，陽(yáng)性藥物對(duì)照組在造模成功后以給藥劑量同體積的地塞米松進(jìn)行灌胃。

2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)：氣道反應(yīng)性的測(cè)定：灌胃結(jié)束后第2天，小動(dòng)物生理儀記錄小鼠的呼吸頻率和潮氣量。肺組織病理學(xué)檢測(cè)：HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。氣道杯狀細(xì)胞的檢測(cè)：PAS染色觀察各組間小鼠肺氣道杯狀細(xì)胞的分布及數(shù)量變化。小鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、AQP5、IL-13的檢測(cè)：小鼠飼養(yǎng)第30 天，禁食12 h后予10 %水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后放血處死小鼠，開(kāi)胸，暴露氣管及肺。用套管針插入左主支氣管并結(jié)扎、固定，拔出針芯后用2 ml冰生理鹽水灌洗左肺，再緩慢回抽，每次回抽液體約1.5 ml，如此反復(fù)灌洗3次，回收率約75%。將回收的灌洗液混勻，先取0.5 ml用細(xì)胞計(jì)數(shù)板行BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)，余下的液體4 ℃，1000 r/min，離心10 min，取上清液-20 ℃保存。使用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中MUC5AC含量。

結(jié) 果

1 各組小鼠吸氣峰流速比較 灌胃結(jié)束后第2天，小動(dòng)物生理儀記錄小鼠吸氣峰流速(Peak value inspiratory velocity of flow，PIF)值。與正常組比較，模型組、清熱潤(rùn)燥各劑量組及陽(yáng)性藥物組的吸氣峰流速比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，清熱潤(rùn)燥各劑量組及陽(yáng)性藥物組的吸氣峰流速比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2 各組小鼠呼氣峰流速比較 灌胃結(jié)束后第2天，小動(dòng)物生理儀記錄小鼠吸氣峰流速(Peak value expiration velocity of flow，PEF)值。與正常組比較，模型組呼氣峰流速明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較，清熱潤(rùn)燥低劑量組呼氣峰流速減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。清熱潤(rùn)燥中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組的呼氣峰流速相比正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，清熱潤(rùn)燥低劑量組呼氣峰流速升高，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，清熱潤(rùn)燥中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組的呼氣峰流速與模型組比較，均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3 各組小鼠呼吸頻率比較 與正常組比較，模型組及清熱潤(rùn)燥低劑量組呼吸頻率(Respiratory rate，R)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。清熱潤(rùn)燥中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。清熱潤(rùn)燥低劑量組呼吸頻率與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。清熱潤(rùn)燥中劑量組的呼吸頻率低于模型組，清熱潤(rùn)燥高劑量組及陽(yáng)性藥物組的呼吸頻率與模型組比較，均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

1993年，美國(guó)國(guó)會(huì)通過(guò)的《政府績(jī)效與結(jié)果法案》，首次從立法上對(duì)美國(guó)聯(lián)邦機(jī)構(gòu)績(jī)效評(píng)價(jià)做出了制度性規(guī)定。該法案將資源和管理決策與績(jī)效掛鉤，建立以績(jī)效為目的的預(yù)算制度，將美國(guó)政府的績(jī)效管理重點(diǎn)由“過(guò)程問(wèn)責(zé)”轉(zhuǎn)向“結(jié)果問(wèn)責(zé)”，由“投入—產(chǎn)出”模式轉(zhuǎn)為“目標(biāo)—結(jié)果”模式[3]，促使聯(lián)邦部門(mén)和機(jī)構(gòu)在預(yù)算中加強(qiáng)“戰(zhàn)略—目標(biāo)—預(yù)算—績(jī)效”的閉環(huán)管理，提高政府管理績(jī)效和服務(wù)效率。

4 各組小鼠肺組織病理學(xué)比較 根據(jù)HE染色結(jié)果可知，正常組小鼠氣管內(nèi)可見(jiàn)少量黏液，氣管黏膜上皮完整、管腔內(nèi)無(wú)黏液滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠氣管內(nèi)有黏液，可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，黏液細(xì)胞不規(guī)則增生，上皮細(xì)胞壞死脫落；血管和氣管周圍，肺泡間隔可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；清熱潤(rùn)燥低劑量組小鼠支氣管管腔可見(jiàn)黏液栓，管壁各層可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌增生，血管和氣管周圍，肺泡間隔可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；清熱潤(rùn)燥中劑量組小鼠血管及氣管周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管壁增厚，細(xì)胞增生；清熱潤(rùn)燥高劑量組小鼠氣管擴(kuò)張，氣管和血管周圍可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞；陽(yáng)性藥物組小鼠血管及氣管周圍可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管壁增厚，細(xì)胞增生(圖1)。

表1 各組小鼠吸氣峰流速、呼氣峰流速及呼吸頻率比較

圖1 各組哮喘小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×20)

5 各組小鼠氣道杯狀細(xì)胞比較 根據(jù)PAS染色結(jié)果(圖2)，正常組小鼠支氣管壁可見(jiàn)零星幾個(gè)杯狀細(xì)胞，呈紫紅色，管腔內(nèi)無(wú)黏液分泌；模型組小鼠氣管壁可見(jiàn)有大量的深染杯狀細(xì)胞增生，呈紫紅色，個(gè)別管腔內(nèi)黏液分泌明顯；清熱潤(rùn)燥低劑量組小鼠與模型組比較，氣管壁中杯狀細(xì)胞減少，呈紫紅色，腔內(nèi)無(wú)黏液分泌；清熱潤(rùn)燥中劑量組小鼠與模型組比較，管壁中的杯狀細(xì)胞較模型組明顯減少，呈紫紅色，個(gè)別支氣管未見(jiàn)杯狀細(xì)胞；清熱潤(rùn)燥高劑量組小鼠與模型組比較，支氣管壁見(jiàn)少量杯狀細(xì)胞，呈紫紅色，腔內(nèi)無(wú)黏液分泌；陽(yáng)性藥物組小鼠支氣管壁有零星幾個(gè)杯狀細(xì)胞，呈紫紅色，管腔內(nèi)無(wú)黏液分泌。

6 各組小鼠BALF中MUC5AC蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組、清熱潤(rùn)燥低劑量組BALF中MUC5AC蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。清熱潤(rùn)燥中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組MUC5AC表達(dá)與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。與模型組比較，清熱潤(rùn)燥低劑量組MUC5AC表達(dá)有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性藥物組及清熱潤(rùn)燥中、高劑量組MUC5AC表達(dá)下降更多，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

7 各組小鼠BALF中AQP5表達(dá)比較 與正常組比較，模型組BALF中AQP5表達(dá)明顯減少，清熱潤(rùn)燥各劑量組和陽(yáng)性藥物組AQP5表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，清熱潤(rùn)燥低劑量組AQP5增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性藥物組及清熱潤(rùn)燥中、高劑量組的AQP5，與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見(jiàn)表2。

8 各組小鼠BALF中IL-13表達(dá)比較 與正常組比較，模型組BALF中IL-13含量明顯增加；清熱潤(rùn)燥低劑量組、中劑量組中IL-13均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。清熱潤(rùn)燥高劑量組、陽(yáng)性藥物組中IL-13與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，清熱潤(rùn)燥低劑量組中的IL-13差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性藥物組，清熱潤(rùn)燥中、高劑量組中的IL-13含量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠BALF中MUC5AC、AQP5、IL-13表達(dá)比較

討 論

哮喘是多種炎癥因子參與的氣道慢性炎癥性疾病[6]，炎性因子IL-13是哮喘發(fā)作的重要原因，其在黏液分泌中作用較為明顯，MUC5AC作為氣道黏液中最為重要的黏蛋白,是呈IL-13誘導(dǎo)性表達(dá)，健康人氣道中MUC5AC含量很少[7]，MUC5AC與哮喘慢性炎癥引起的氣道黏液高分泌有密切關(guān)系[8]；水分是氣道黏液的重要組成部分，氣道黏液95%以上都是水分，而水通道蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)生理和細(xì)胞對(duì)液體體積和滲透壓變化的反應(yīng)，來(lái)進(jìn)行整個(gè)生物體內(nèi)水分平衡的基本系統(tǒng)調(diào)節(jié)[9]，在肺組織中，水通道蛋白5是主要的水轉(zhuǎn)運(yùn)通道之一，其減少將導(dǎo)致氣道水分分泌的減少[10]，進(jìn)而引起氣道黏液的黏稠度增加，使其更加難以排出氣道。AQP5的異常表達(dá)與支氣管哮喘水液代謝失衡及氣道黏液高分泌有著密切聯(lián)系，是近年來(lái)研究支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的新方向[11-13]。

在本次實(shí)驗(yàn)中，哮喘模型小鼠氣道病理染色表現(xiàn)出炎細(xì)胞浸潤(rùn)、MUC5AC明顯增多，提示構(gòu)建的模型符合氣道黏液高分泌模型。與模型組比較，地塞米松組及清熱潤(rùn)燥中、高劑量組炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組好轉(zhuǎn)，且能明顯減少IL-13、降低MUC5AC的表達(dá)同時(shí)增強(qiáng)了AQP5蛋白的表達(dá)。黏蛋白分子原本參與組成呼吸道黏液，有保護(hù)和潤(rùn)滑上皮的作用，但在感染、過(guò)敏原等多種因素的影響下，氣道上皮分泌MUC5AC便顯著增加，引起了氣道黏液的高分泌[13]；AQP5主要分布在哺乳動(dòng)物的唾液腺、肺泡Ⅰ型細(xì)胞、上呼吸道分泌上皮細(xì)胞等[14-15],作為肺組織中主要水通道蛋白,可幫助水分子快速通過(guò)質(zhì)膜移動(dòng)，幫助氣道及肺內(nèi)液體的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn),并參與氣道黏液的分泌與調(diào)節(jié)[16]。哮喘患者，尤其是慢性哮喘或者咳嗽變異性哮喘的患者，常常感覺(jué)咽干、痰難以咯出，這是腺體結(jié)構(gòu)或功能受損、唾液分泌減少所致，而腺體，尤其是涎腺的分泌調(diào)控作用與AQP5的異常分布密切相關(guān)[17]。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，清熱潤(rùn)燥口服液可增加BALF中AQP5的表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)中與正常組比較，模型組BALF中IL-13含量明顯增加，證明氣道黏液高分泌的小鼠IL-13值是升高的，低劑量組小鼠BALF中的IL-13含量比模型組低，地塞米松藥物組及清熱潤(rùn)燥中、高劑量組中的IL-13明顯降低，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)MUC5AC及AQP5的結(jié)果，提出IL-13與MUC5AC值呈正相關(guān)，與AQP5值呈負(fù)相關(guān)的設(shè)想，但其具體的作用機(jī)制及通路有待研究。

哮喘屬于中醫(yī)“哮病”的范疇，《癥因脈治·喘促》：“哮病之因，痰飲留伏，結(jié)成窠臼，潛伏于內(nèi)，偶有七情之犯，飲食之傷，或外有時(shí)令之風(fēng)寒束其肌表，則哮喘之癥作矣”?！疤怠背Ｓ煽韧隆⒖瓤┒?，中醫(yī)有“肺為嬌臟，喜潤(rùn)惡燥”之說(shuō)，或因環(huán)境等“外燥”原因、或因飲食、遺傳等“內(nèi)燥”原因或內(nèi)外原因共同致病導(dǎo)致“內(nèi)外合燥”傷及肺臟，灼傷肺津，肺失宣肅，上焦水津不能通降與布散，便停聚于肺化為痰飲，痰伏于肺，成為發(fā)病的潛在“夙根”，此類“伏痰”色黃或白而黏稠，堅(jiān)而成塊[18]，遇各類誘因即發(fā)，但因其堅(jiān)硬難排，故可見(jiàn)干咳、痰難咯等癥狀。所以從減少痰液生成、促進(jìn)痰液排出，通過(guò)“潤(rùn)養(yǎng)”與“通利”[3]治療本病。

潤(rùn)養(yǎng)，一取其潤(rùn)養(yǎng)脾胃之效，其中沙參、麥冬合用，益氣且養(yǎng)胃陰,脾胃為人體氣機(jī)升降的樞紐，脾胃功能正常則中氣盛，津液上可輸布于肺，配合白扁豆、山藥等補(bǔ)脾、實(shí)脾之品起“培土生金”之效，下能滋腎，以達(dá)“金水相生”之功[19]。肺腎互資，陰津充盛，達(dá)“潤(rùn)養(yǎng)”以化燥。二取其潤(rùn)養(yǎng)肺臟之效，肺為嬌臟，喜濕惡燥，方中桑葉為君藥，苦能潤(rùn)燥、甘能生津，其性清輕上揚(yáng)，其形同肺葉，故最能入肺經(jīng)潤(rùn)肺燥，津液滋潤(rùn)肺部，使伏痰、燥痰得以潤(rùn)化，而得以排出。通利，其一通利氣道得伏痰能排出，其二通利水道，使津液能潤(rùn)布各個(gè)臟腑。除了健脾胃、滋潤(rùn)肺腎使津液得以布輸之外，甘寒之蘆根為佐藥，清熱生津，利濕通利，宣肺氣于上而通達(dá)水濕于下，蘆根及薏苡仁、冬瓜仁三藥合用通利三焦,浙貝母配以陳皮行氣利痰,使痰得以“通利”隨氣化外達(dá),氣道通暢，肺之宣降功能正常,氣可載津，津液輸布有則；水道通暢，津液充足以助氣化，既可正常布散津液又可使邪外排，是以本方以辛涼甘潤(rùn)之法潤(rùn)養(yǎng)脾胃、資肺津腎陰，通利氣道水道使運(yùn)化有則，氣道順暢，津液得以輸布、痰濁得以排出。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本藥對(duì)于慢性哮喘或者哮喘合并慢性阻塞性肺疾病，尤其是以干咳、痰液難以咯出為主要癥狀的患者效果更佳，由此提出，清熱潤(rùn)燥口服液潤(rùn)養(yǎng)與通利的理論，是通過(guò)其激活上皮細(xì)胞中AQP5的表達(dá)，改善了氣道的水液代謝，提高了肺組織濕的比重，從而稀釋痰液使其稀薄而易于排出，是以顯示了“潤(rùn)養(yǎng)”氣道，稀釋痰液的作用，同時(shí)本藥可以拮抗哮喘氣道炎癥反應(yīng)、減少M(fèi)UC5AC的生成，通過(guò)減少氣道黏液的分泌起到“通利”氣道的作用，從而有效緩解哮喘發(fā)作時(shí)的咳嗽、喘息等癥。

綜上，本次實(shí)驗(yàn)初步探討“清熱潤(rùn)燥口服液”對(duì)哮喘小鼠BALF中MUC5AC以及AQP5的影響，證明本方可以通過(guò)抑制MUC5AC表達(dá)以及增強(qiáng)AQP5的表達(dá)來(lái)抑制氣道黏液高分泌、改善氣道炎癥以及調(diào)節(jié)氣道的水液代謝失衡，本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也部分符合“潤(rùn)養(yǎng)”與“通利”的治療理論，但本次測(cè)試的因子較少，故其具體作用機(jī)制及通路有待進(jìn)一步研究。