劉 溪，張 慧，馮思娜，李笑雨

1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院(咸陽712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(咸陽712021)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是一種以高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率為特征的腦血管疾病，在臨床中占中風發(fā)病總數(shù)的60%～80%[1-2]，中風是僅次于缺血性心臟病的第二大死因，占全世界死亡人數(shù)的9%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，全世界每年有1500萬人患中風。其中有600多萬人死亡，另有500萬人永久致殘，嚴重危害人類生命和健康[1]。因此，探索CIS的新治療方法，促進CIS患者神經(jīng)功能的恢復，降低殘廢率、改善預后，具有重要意義。益陰通絡膠囊是陜西省名老中醫(yī)楊秀清教授用于治療缺血性腦卒中的經(jīng)驗方，現(xiàn)已開發(fā)為陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑使用。本方具有滋補肝腎，化痰開竅，活血通絡功效，臨床上主要用于治療中風病所致肢體癱瘓、麻木、無力、頭暈耳鳴、語言不利、煩躁不眠、面紅口干，舌紅苔少等癥。本實驗擬通過對缺血性腦卒中大鼠血清中一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、大鼠腦勻漿中Na+-K+-ATP酶活性及缺血性腦卒中后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、腦組織病理改變的實驗研究來探討益陰通絡膠囊保護腦神經(jīng)細胞、修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用機制及治療缺血性腦血管病的作用機理，為益陰通絡膠囊作為治療缺血性腦血管病的有效中藥復方提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：SD大鼠90只，平均體重(280±30)g，雌雄各半。由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證書號：SCXK(陜)2007-001。

1.2 實驗藥物和試劑：益陰通絡膠囊，由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心提供，按每克含生藥3.6 g標準制備，批號:20080104。血塞通片(云南省玉溪市維和制藥有限公司生產(chǎn)，批號:20080206)。NOS試劑盒、SOD試劑盒、Na+-K+-ATP酶試劑盒、考馬斯亮蘭測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。注射用青霉素鈉粉針劑(國藥準字23021439，瑞陽制藥有限公司)；10%水合氯醛溶液(由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心提供)。

1.3 實驗儀器：LD4-2型低速離心機、OLYMpUS CX31型電子顯微鏡、723分光光度計、FJ-2103γ免疫計數(shù)儀。

2 實驗方法

2.1 腦缺血大鼠模型制備：線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型是常用的缺血性腦卒中動物模型。造模方法參照文獻[2],具體操作如下：大鼠術(shù)前禁食一夜后，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠并固定于手術(shù)臺上，頸部去毛，碘伏消毒，頸部前正中線切開皮膚，沿右側(cè)胸鎖乳突肌后氣管旁鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，并在靠近頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端，并在距離頸總動脈分叉處3 mm處的頸動脈上剪開一小口，將一根頭端處理過的0.33 mm直徑的尼龍線從小口中插入，緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進，尼龍線的插入深度距離頸總動脈分叉處約(18.0±0.5) mm左右時感到阻力，缺血后1 h拔掉線栓，縫合頸部傷口。腹腔注射青霉素4萬U/d，預防術(shù)后感染，連用 3 d。假手術(shù)組不插入線栓，不閉塞MCA，其他操作同模型組。

2.2 分組及給藥：空白組及假手術(shù)組各8只；造模后24 h參考Bederson評分法[3]對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分。死亡及評分小于2分的大鼠剔除，采用隨機分組法將造模成功并符合入選標準的40只大鼠(90只大鼠中10只進行預實驗，手術(shù)期間及術(shù)后死亡19只，模型未成功5只)分為模型組、血塞通陽性對照組(0.03 g/kg)、益陰通絡膠囊小、中、大(0.21 g/kg、0.42 g/kg、0.84 g/kg)劑量組，每組8只，按1 ml/100g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d?？瞻捉M不給予任何處理，假手術(shù)組及模型組灌胃生理鹽水。給藥7 d后進行指標檢測。

2.3 神經(jīng)功能缺損評分：在術(shù)后24 h及治療后第8天,參照Bederson 6級5分法[3]對大鼠神經(jīng)功能評分。正常為5級(0分)；不能完全伸展對側(cè)上肢為4級(1分)；向麻痹側(cè)的側(cè)向推力的抵抗力降低為3級(2分)；提尾時向外側(cè)轉(zhuǎn)圈為2級(3分)；自動轉(zhuǎn)圈為1級(4分)；無自發(fā)性活動、意識喪失為0級(5分)。

2.4 標本采集與指標檢測：灌胃結(jié)束，以10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉后心臟取血，室溫靜置5 min后，3000 r/min離心15 min，取血清，NOS活性測定采用NOS催化L-Arg和分子氧反應生成NO,NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物,比色測定OD值。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。按SOD測定試劑盒說明書進行檢測，蛋白含量用考馬斯亮蘭法測定。取血后大鼠斷頭取腦，左右腦分開，左半腦用于制備腦勻漿。采用Na+-K+-ATP酶測定試劑盒，分別取2%腦組織勻漿1 ml(10%的組織勻漿0.2 ml加0.8 ml生理鹽水稀釋)3000～4000 r/min，離心10 min，取上清液200 μl定磷。然后再用漩渦混勻器混勻，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，在660 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色測出吸光度。按公式計算Na+-K+-ATP酶活性。

2.5 腦組織病理學檢查：取血后各組大鼠開顱取腦，將右側(cè)腦組織放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24 h，4 ℃冰箱保存。切取視交叉后0.5 mm處至小腦前的腦組織，用磷酸鹽緩沖液反復漂洗，乙醇脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE染色并在10×40光倍鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理改變。具體包括：神經(jīng)細胞、神經(jīng)細胞樹突、軸突、尼氏體的病理改變。

3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為學觀察 空白組、假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺損癥狀。其他各組大鼠均有典型神經(jīng)功能缺損癥狀，得分多在2～4分之間，大鼠整體上表現(xiàn)活動不自如、精神萎靡、反應遲緩、毛色泛黃、缺乏光澤，進食與飲水量明顯減少。

2 大鼠神經(jīng)功能缺損分級比較 治療期間，空白組及假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀，整體精神狀態(tài)良好，活動自如，毛色白有光澤，飲水進食無異常，符合預期。模型組大鼠在造模后神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，得分在2～4分，精神不振，活動少且遲鈍，毛色偏黃無光澤，毛松散蓬亂，飲水進食較少，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明模型復制成功。各組大鼠7 d后精神狀態(tài)良好，進食飲水正常，毛色光亮，神經(jīng)功能缺損癥狀明顯減輕，得分多在0～1分。與模型組比較，益陰通絡膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組神經(jīng)功能缺損5級比例均高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。益陰通絡膠囊大、中劑量組神經(jīng)缺損評級中5級比例高于血塞通陽性對照組及益陰通絡膠囊小劑量組。從大鼠行為學觀察比較，可以看出益陰通絡膠囊對神經(jīng)功能缺損癥狀有改善作用，以益陰通絡膠囊大、中劑量組的5級比例較高。見表1。

表1 各組大鼠治療后神經(jīng)功能缺損分級比較(只)

3 大鼠血清NOS測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組血清NOS活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明模型復制成功。益陰通絡膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組NOS活性較模型組升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示益陰通絡膠囊小、中、大劑量及血塞通均具有升高大鼠血清NOS活性的作用。益陰通絡膠囊中、大劑量組升高NOS活性優(yōu)于血塞通陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與益陰通絡膠囊小劑量組相比較，大、中劑量組中NOS活性升高明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示益陰通絡膠囊大、中劑量對腦缺血損傷治療作用優(yōu)于血塞通及益陰通絡小劑量。見表2。

4 大鼠血清中SOD活性檢測結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，模型組血清中SOD活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，益陰通絡膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組SOD活性均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。益陰通絡膠囊中、大劑量組與血塞通陽性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與益陰通絡膠囊小劑量組比較，益陰通絡膠囊中、大劑量組中SOD活性更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明益陰通絡膠囊中、大劑量均能改善腦缺血所引起的病理生理改變，且優(yōu)于益陰通絡膠囊小劑量與血塞通。見表3。

表2 各組大鼠血清NOS 活性比較(μmol/L)

表3 各組大鼠血清中SOD活性比較(μmol/L)

5 大鼠腦組織勻漿Na+-K+-ATP酶活性測定情況 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明模型復制成功。與模型組比較，益陰通絡膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組Na+-K+-ATP酶活性均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與血塞通陽性對照組相比，益陰通絡膠囊大、中劑量組Na+-K+-ATP酶活性升高更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與益陰通絡膠囊小劑量組相比較，益陰通絡膠囊大、中劑量組Na+-K+-ATP酶活性升高明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明益陰通絡膠囊大、中劑量均對腦缺血損傷的有治療作用，優(yōu)于血塞通及益陰通絡膠囊小劑量。見表4。

表4 各組大鼠腦組織勻漿Na+-K+-ATP酶活性比較[μmolpi/(mgprot·hour)]

6 各組大鼠腦缺血病理學改變 比較各組大鼠腦缺血病理學改變，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的腦缺血病理改變，如神經(jīng)細胞水腫、壞死、尼氏體變淡、間質(zhì)充血、神經(jīng)細胞軸、樹突減少；而血塞通陽性對照組、益陰通絡膠囊小、中、大劑量組均比模型組改變輕(圖1)。

A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：血塞通陽性對照組；E：益陰通絡膠囊小劑量組；F：益陰通絡膠囊中劑量組；G：益陰通絡膠囊大劑量組

討 論

中風已成為對人們不可避免的問題，并給受害者的家庭和社會帶來了沉重的負擔[4]。中藥可通過多種機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用，包括神經(jīng)保護、抗炎、抗凋亡、抗氧化、血管保護劑、記憶促進劑、功能改善劑、毒素抑制劑等，并發(fā)掘出一系列藥物，如銀杏葉提取物[5]、三七[6]、綠茶提取物[7]、川芎[8]等，但同時發(fā)現(xiàn)許多單一提取的中藥成分往往在動物實驗中有效，而在臨床治療時面臨療效不佳或治療面較窄等問題。中藥的復方制劑在辨證的基礎上隨證加減，靈活組方，且長時間使用副作用較小[9]。本研究通過對益陰通絡膠囊缺血性腦卒中大鼠血清NOS、SOD、腦勻漿Na+-K+-ATP酶活性及神經(jīng)功能缺損評分、腦組織病理改變進行的研究，為臨床有效用藥提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，益陰通絡膠囊能改善腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、能有效地升高大鼠腦缺血后血清NOS 活性、SOD活性、腦組織中Na+-K+-ATP酶活性，達到減輕腦缺血損傷的作用。益陰通絡膠囊能減輕神經(jīng)元的缺血性損傷程度，從病理證實該方對缺血再灌注后腦損傷治療作用。

NOS是一氧化氮合成的限速酶，是調(diào)節(jié)NO含量的最重要環(huán)節(jié)[10]。NO是一種血管擴張劑，具有抗平滑肌細胞活性，保護內(nèi)皮，抑制血小板粘附、聚集、白細胞粘附和趨化并具有其他抗炎特性。此外，它是一種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑,參與腦血流的自動和化學調(diào)節(jié)[11]。SOD是體內(nèi)最有效的氧自由基清除劑，它可以使CRI后產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶變?yōu)樗?，以減輕組織損傷。組織內(nèi)SOD活性的高低可反映機體清除自由基的能力，與體內(nèi)自由基總體水平呈負相關[12]。Na+-K+-ATP酶活動是大腦正常神經(jīng)元功能的重要組成部分。研究表明Na+-K+-ATP酶可能是對抗興奮性毒性的重要靶標，Na+-K+-ATP酶可以控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)Ca2+的濃度，影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放，并防止在興奮性毒性應激中Ca2+超載和神經(jīng)元凋亡[13]。

益陰通絡膠囊針對肝腎陰虛、瘀阻腦絡之中風而設。方中生地黃、山茱萸為君，生地黃清熱涼血，補益肝腎，澀精固脫。山茱萸味酸、澀，滋陰益血。五味子、石菖蒲、遠志、茯苓為臣藥，五味子收斂固澀、益氣生津、補腎寧心，既能滋腎以育木，又能與生地、山茱萸相裨益。石菖蒲開竅豁痰健胃。遠志安神益智，交通心神。茯苓健脾、寧心，能提高機體免疫力，為中藥四君八珍之一。川芎、雞血藤、水蛭為使藥?！侗静輩R言》：“川芎，上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)……雖入血分，又能祛一切風，調(diào)一切氣?！彪u血藤補血活血通絡?！兑幏謩分杏涊d水蛭主治為：“入肝、膀胱二經(jīng)”，具有破血、逐瘀之功，有不傷正氣，生新血之說。諸藥合用，共奏滋補肝腎、化痰開竅、活血通絡之功。血塞通，由三七總皂苷組成，具有活血化瘀、通絡的作用?？梢詳U張血管，抑制血小板聚集，降低血漿黏度。用于腦脈瘀阻所致的中風[14]。該藥用于臨床多年，療效較好。故選用此藥為對照藥。

本實驗結(jié)果說明，益陰通絡膠囊能提高腦缺血大鼠NOS、SOD、Na+-K+-ATP酶的活性，改善腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀及神經(jīng)元等結(jié)構(gòu)的完整性，減輕自由基損傷，阻止腦缺血性神經(jīng)元損傷，促進局部微血流，改善微循環(huán)狀態(tài)，保護損傷腦組織，從而發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用。