劉東海，張學(xué)江，王 鵬，胡 誠(chéng)，喬 艷，張 智，李雙來(lái)

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064；2.棗陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 棗陽(yáng) 441200）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的組分［1］，通過(guò)參與有機(jī)質(zhì)的降解、腐殖質(zhì)的形成和土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)等途徑維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力，是反映土壤環(huán)境的重要敏感指標(biāo)［2，3］，同時(shí)土壤微生物的數(shù)量和活性與植物發(fā)病率有密切的關(guān)系［4］。小麥（Triticum aestivumL.）根腐病是重要的土傳真菌病害，在世界各地廣泛分布，在小麥整個(gè)生育期都可發(fā)生根腐病害。該病害由麥根腐平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）［5，6］、鐮刀菌（Fusariumspp.）［7，8］等多種土壤病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起，嚴(yán)重影響小麥生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)［9］。在澳大利亞［10］、美國(guó)西北太平洋地區(qū)［11，12］，黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是當(dāng)?shù)匦←湼〉闹饕≡?；中?guó)黃淮麥區(qū)、西北地區(qū)根腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌是根腐平臍蠕孢菌［13-15］。施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要措施之一，長(zhǎng)期施肥可改變土壤理化性質(zhì)和生物活性，影響作物產(chǎn)量［16］以及土壤養(yǎng)分微生物生物量及功能多樣性［17，18］；施肥也影響麥類根腐病害的發(fā)生，劉歡歡等［19］指出生態(tài)炭肥對(duì)小麥根腐病的防效及對(duì)土壤健康修復(fù)作用存在正劑量效應(yīng)。劉蘋(píng)等［20］指出復(fù)合生物有機(jī)肥和微生物菌有機(jī)肥能有效提高土壤中性磷酸酶活性，促進(jìn)磷素循環(huán)，增強(qiáng)拮抗和有益微生物對(duì)禾谷鐮孢菌的抗性并促進(jìn)小麥生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)設(shè)置不同施肥處理來(lái)研究施肥對(duì)小麥根際土壤真菌微生物多樣性及根腐病的影響，旨在為小麥根腐病的田間管理提供切實(shí)可行的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

2018—2019年在湖北省棗陽(yáng)市南城辦事處后湖村（E112°42′01″，N31°59′41″）開(kāi)展2季不同施肥影響根腐病害的試驗(yàn)。土壤類型為潴育型水稻土，白散泥田。前茬作物為水稻。土壤有機(jī)質(zhì)含量為23.34 g/kg，有效磷含量為11.21 mg/kg、速效鉀含量為92.91 mg/kg，pH 5.49。小麥生育期內(nèi)大于10℃的有效積溫為1 914.2℃；降雨量為219.4 mm；最低氣溫為-5.9℃；日照時(shí)數(shù)為853.1 h。小麥生育期早期陰雨，后期干旱。供試小麥品種為鄂麥580。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為不施肥（T1）、習(xí)慣施肥（T2）、推薦施肥（T3）和有機(jī)肥替代50%化肥（T4）處理。重復(fù)3次，小區(qū)面積105 m2，隨機(jī)排列。習(xí)慣施肥施肥量N為195 kg/hm2，P2O5為67.5 kg/hm2，K2O為60 kg/hm2。推薦施肥和有機(jī)肥替代化肥處理施肥量N為150 kg/hm2，P2O5為60 kg/hm2，K2O為5 kg/hm2。供試肥料氮肥為尿素（N，46%），磷肥為過(guò)磷酸鈣（P2O5，12%），鉀肥為氯化鉀（K2O，60%）；商品有機(jī)肥（湖北雙港農(nóng)業(yè)科技貿(mào)易股份有限公司），養(yǎng)分含量N、P2O5、K2O分別為3.57%、3.38%、3.92%。

10月20日機(jī)械條播，行寬27 cm，播種量225 kg/hm2。10月28日灌水抗旱，12月8日化學(xué)除草，3月6日防治麥園蜘蛛和蚜蟲(chóng)，3月27日破口抽穗，4月6日齊穗，4月11日每公頃用戊唑·多菌靈懸浮劑1 500 mL對(duì)水375 kg防治小麥赤霉病，4月23日用艾美樂(lè)防治穗蚜，5月26日成熟收割。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 于2019年小麥?zhǔn)斋@后進(jìn)行土壤樣品采集，采樣深度為0～20 cm，每個(gè)小區(qū)按梅花型5點(diǎn)采樣，剔除石礫和植物殘根等雜物后混合，每個(gè)小區(qū)的混合土樣分為兩部分，一部分用于化學(xué)指標(biāo)測(cè)試，另一部分放置于-80℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量測(cè)序。

1.3.2 土壤理化性狀分析 堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷含量采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，速效鉀含量采用火焰光度法測(cè)定，有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀法測(cè)定，土壤pH采用1∶2.5的水土比、復(fù)合電極測(cè)定［21］。

1.3.3 小麥根腐病調(diào)查 小麥?zhǔn)斋@期進(jìn)行根腐病調(diào)查，采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)20株，調(diào)查病害的發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=Σ（各級(jí)發(fā)病數(shù)級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別代表值）×100%。小麥成熟期根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照胡艷峰［13］的方法劃分：0級(jí)，根莖基本無(wú)癥狀；1級(jí)，根莖基部有褐色小病斑；2級(jí)，根莖基部有梭形病斑；3級(jí)，根莖基部梭形病斑延伸擴(kuò)展或腐爛；4級(jí)，根莖基部嚴(yán)重腐爛，植株枯萎。

1.3.4 土壤DNA的提取及MiSeq sequencing測(cè)序?qū)Σ煌幚硗寥罉悠凡捎肊.Z.N.A?Soil NDA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提 取 土 壤 總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。對(duì)18S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor TM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq PE 250平臺(tái)分別進(jìn)行真菌的測(cè)序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 20.0軟件的Tukey法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的表征

2.1.1 高通量測(cè)序結(jié)果及α多樣性指數(shù) 從圖1可以看出，稀釋曲線都趨向平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。12個(gè)樣本共得到真菌539 137個(gè)有效序列，平均長(zhǎng)度為401.68 bp；所有樣本按照最小樣本序列數(shù)（31 751 reads）進(jìn)行抽平處理，然后按照97%相似度劃分，共得到1域12界33門(mén)57綱79目94科102屬145種248 OTUs。

圖1 真菌稀釋曲線

從表1可以看出，不同施肥處理真菌群落豐富度指數(shù)從大到小依次為T(mén)4、T1、T2、T3，Shannon多樣性指數(shù)從大到小依次為T(mén)1、T2、T4、T3，但2個(gè)指標(biāo)各處理間無(wú)顯著差異；各處理真菌群落的覆蓋度為99.91%～99.92%。由此可知，施化肥在一定程度上降低了真菌的豐富度和多樣性指數(shù)，施用有機(jī)肥增加了真菌的豐富度指數(shù)。

表1 不同施肥處理的土壤真菌α-多樣性指數(shù)

2.1.2 不同施肥處理下真菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu) 土壤真菌門(mén)水平群落相對(duì)豐度如圖2a所示。不同施肥導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)聚為3類，T3和T4聚為一類；T2聚為一類；T1單獨(dú)一類（圖2b）。真菌（門(mén)水平）群落組成主要是子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），二者占到群落組成的92.57%～94.55%。其中，子囊菌門(mén)在T2處理中的相對(duì)豐度最高（85.48%），顯著高于T4和T1處理；擔(dān)子菌門(mén)在T1處理的相對(duì)豐度最高（21.29%），顯著高于T2和T3處理。與有機(jī)肥替代50%化肥的T4處理相比，習(xí)慣施肥的T2處理顯著提高了子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，但降低了擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度。

2.2 不同施肥處理對(duì)土壤理化性質(zhì)、根系活力和產(chǎn)量的影響

圖2 不同施肥處理對(duì)門(mén)水平真菌相對(duì)豐度的影響（a）及聚類分析（b）

不同施肥處理對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響，具體見(jiàn)表2。與不施肥處理相比，所有施肥處理土壤pH均有所下降，下降幅度為0.21～0.44個(gè)單位，其中習(xí)慣施肥處理下降幅度最大，有機(jī)肥替代50%化肥處理下降幅度最小。推薦施肥有利于提高土壤堿解氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)碳含量。小麥根系活力從大到小依次為T(mén)4、T3、T2、T1。T2和T3處理的產(chǎn)量分別為5 945.40 kg/hm2和5 878.95 kg/hm2，差異不顯著；T4處理產(chǎn)量為4 767.15 kg/hm2，顯著低于T2和T3，可能是由于當(dāng)季有效養(yǎng)分不足導(dǎo)致的減產(chǎn)；T1產(chǎn)量最低，為2 402.70 kg/hm2。

表2 不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)及產(chǎn)量

2.3 土壤真菌種水平菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子分析

土壤真菌種水平群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子分析如圖3所示。pH和速效鉀聚為一類，有機(jī)碳（SOC）和堿解氮聚為一類，速效磷聚為一類。小麥根腐病的致病菌麥根腐平臍蠕孢和禾谷鐮刀菌與環(huán)境因子的相關(guān)性如表3所示。小麥根腐病的致病菌麥根腐平臍蠕孢與土壤堿解氮、速效磷和有機(jī)碳含量呈正相關(guān)，與速效鉀含量和pH呈負(fù)相關(guān)，但不顯著；致病菌禾谷鐮刀菌與土壤pH和速效磷含量呈正相關(guān)，與土壤有機(jī)碳、堿解氮和速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性也不顯著。這可能由于稻麥輪作下，減弱了小麥根腐病致病菌與環(huán)境因子間的相關(guān)性。

圖3 真菌種水平群落環(huán)境因子分析

表3 根腐病致病菌相對(duì)豐度與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)

2.4 不同施肥處理對(duì)小麥根腐病菌及其病情指數(shù)的影響

由表4和圖4可知，不同施肥處理下的禾谷鐮刀菌和麥根腐平臍蠕孢的相對(duì)豐度不同，各施肥處理禾谷鐮刀菌的相對(duì)豐度由高到低依次為T(mén)2、T4、T3、T1，麥根腐平臍蠕孢的豐度依次為T(mén)3、T1、T4、T2。不同施肥處理的根腐病病情指數(shù)從大到小依次為T(mén)1、T2、T3、T4。

表4 不同施肥處理對(duì)根腐病致病菌及其病情指數(shù)的影響

圖4 不同施肥處理對(duì)真菌種水平相對(duì)豐度的影響

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，施用化肥可降低真菌的豐富度和多樣性，與張宇亭［22］研究的結(jié)論一致，主要原因?yàn)殚L(zhǎng)期施用化肥造成了酸性和中性土壤pH的降低。有機(jī)肥替代50%的化肥可增加真菌的豐富度指數(shù)，比推薦施肥處理多樣性指數(shù)高，可能因?yàn)橛袡C(jī)和無(wú)機(jī)肥配施可提高微生物群落多樣性［23］。因此細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性水平等指標(biāo)可間接地指示土壤肥力及致病能力［24］。

長(zhǎng)期不同施肥可以改變真菌群落結(jié)構(gòu)［25，26］。本研究不同施肥量條件下的土壤真菌群落可聚為3類，其中T3和T4聚為一類，T2聚為一類，T1單獨(dú)一類。施化肥比有機(jī)肥替代更能提高子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，但降低了擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度，即施有機(jī)肥可提高微生物群落多樣性。

不同施肥對(duì)土壤基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了不同影響。施用化肥處理降低了土壤pH，施用有機(jī)肥減緩了pH的下降，與Zhang等［27］的研究結(jié)果一致。有機(jī)肥替代50%化肥處理的產(chǎn)量低于推薦施肥和習(xí)慣施肥處理。歐楊虹［28］指出低量有機(jī)肥氮（25%）替代化肥氮處理的子粒產(chǎn)量與單施化肥氮相當(dāng)，只有合適比例的有機(jī)肥氮部分替代化肥氮施用才能維持高產(chǎn)。李靜［29］指出50%NPK+6 000 kg/hm2豬糞處理的產(chǎn)量比單施化肥高，且豬糞的養(yǎng)分含量高于50%NPK才能保障產(chǎn)量。

小麥根腐病已成為世界許多小麥種植區(qū)的主要病害之一。根腐病的發(fā)病程度與土壤施肥情況有關(guān)，F(xiàn)ernandez等［30］和Tinline等［31］發(fā)現(xiàn)在低氮情況下，根腐病的發(fā)病情況明顯減輕，與低氮條件下土壤中鐮刀菌的減少有關(guān)。本研究不同施肥條件下禾谷鐮刀菌在真菌群落中的相對(duì)豐度跟施肥量多少相關(guān)，從大到小依次為T(mén)2、T4、T3、T1，但是與根腐病病情指數(shù)并不相符，這是因?yàn)楦∈怯蓮?fù)合侵染引起的。T4處理的根腐病指數(shù)最低，說(shuō)明施用有機(jī)肥能夠降低根腐病發(fā)病率，與文獻(xiàn)報(bào)道有機(jī)肥可降低病原菌的相對(duì)豐度，進(jìn)而對(duì)土壤致病菌有明顯抑制作 用［26，32，33］結(jié) 論 一 致?？?能 因 為：有 機(jī) 肥 中 的 木霉［34］、枯草芽孢桿菌［35］和放線菌［36］可以抑制致病菌；有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)成分除可通過(guò)改善土壤結(jié)構(gòu)修復(fù)土壤肥力外，還可以有效地控制土傳細(xì)菌及真菌病害［37，38］。因此，施用有機(jī)肥有利于小麥根腐病的防治。