楊宋琪，魏喜紅，王麗娟，楊生輝，羅光宏

(1.河西學院 甘肅省微藻工程技術創(chuàng)新中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；2.西南大學 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715)

微藻因生長周期短、繁殖速率快、油脂含量高、無污染以及培養(yǎng)不占耕地等特點，在眾多生物質能源原料中備受關注[1]。斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)是廣泛分布于河、湖、庫、塘、土壤等生境的一種綠藻，容易分離純化獲得。近年來，斜生柵藻因其相對較高的油脂產率而被廣泛研究[2-5]。研究表明，斜生柵藻油脂組成以C16、C18系脂肪酸為主，且油脂含量占干重的11%～55%[6]，適宜于生產生物柴油。

氮是藻類生長必需的元素之一，是蛋白質和葉綠素等物質的重要組成部分，對藻類生長、繁殖等生理活動有著重要的作用[7]。自然界中，藻類可利用硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、氮氣、尿素等作為必需氮源[8]。培養(yǎng)過程中，氮源的選擇以及濃度的變化可以顯著影響藻的生長速率、光合、油脂的積累及成分組成[9]。碳元素約占藻細胞干重的50%，是藻細胞的主要組成部分[10]，也是保證藻細胞大量積累油脂的必要條件[11]。碳源作為營養(yǎng)物質被藻類利用進行有機物的合成和代謝產物的積累，一些藻類可以利用不同外加碳源進行自養(yǎng)和異養(yǎng)生長并顯著提升生物量和油脂產率[12]，小球藻亦可利用不同無機碳進行快速生長并顯著提升油脂產率[13]。

目前，許多學者集中在單一氮、碳、磷營養(yǎng)鹽對微藻油脂積累的影響研究，而針對不同氮、碳源組合培養(yǎng)探究藻類生長及油脂產率的研究較少。因此，本研究以斜生柵藻為研究材料，為獲得其適宜的氮源與碳源組合培養(yǎng)條件，選取4種常見氮源和3種不同形式碳源兩兩組合進行室內培養(yǎng)，對其生長、光合、油脂產率及油脂脂肪酸組成進行比較分析，為斜生柵藻生物量和油脂積累條件的篩選提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)FACHB-416，購自中國科學院水生生物研究所藻種庫。培養(yǎng)基所用氮源為尿素、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨，碳源為碳酸鈉、葡萄糖和乙酸鈉。

DR6000紫外-可見分光光度計(美國哈希)，植物效率分析儀(英國漢莎科技有限公司)，BT48冷凍干燥機(Millrock)，RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀，氮吹儀，GC-2014C氣相色譜(日本島津)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

根據表1將4種氮源和3種碳源兩兩組合，并以BG-11培養(yǎng)基氮、碳含量為依據分別進行相應氮、碳源的添加，共計12組。首先將斜生柵藻擴大培養(yǎng)至對數期，再將藻液進行離心、洗滌，并轉接至無氮、無碳培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)3 d。饑餓培養(yǎng)后的藻離心收集后分別接入1.5 L含有不同氮、碳源培養(yǎng)基的柱狀反應器中，初始藻密度(OD680)為0.1。整個培養(yǎng)過程溫度(25±1)℃，光照強度80 μmol/(m2·s)，光暗比12 h∶12 h，培養(yǎng)期間每天定時攪動藻液3次。

表1 斜生柵藻培養(yǎng)的不同氮、碳源含量及編號

1.2.2 生長曲線及比生長速率

每24 h測定培養(yǎng)藻液的OD680，制作斜生柵藻生長曲線。

比生長速率計算公式為：

(1)

μmax=max(μ1,μ2,μ3,…μn)

(2)

式中：μ為斜生柵藻在某一時間段內的比生長速率；μmax為最大比生長速率；x2為t2時間的藻類生物量；x1為t1時間的藻類生物量。

1.2.3 葉綠素a含量的測定

參照文獻[14]方法，各取5 mL的藻液進行離心(7 000 r/min，10 min)，去除上清液后的藻細胞用90%的丙酮在4℃條件下黑暗提取24 h，提取液定容至10 mL后用紫外-可見分光光度計分別測定663、645 nm處吸光值。葉綠素a含量(C)按下式計算。

C=(8.02OD663+20.21OD645)

(3)

1.2.4 最大光量子產率(Fv/Fm)的測定

取對數期藻液2.3 mL暗適應20 min后，采用植物效率分析儀測定斜生柵藻最大光量子產率(Fv/Fm)，測定光強為3 000 μmol/(m2·s)，最大激發(fā)波長為650 nm。

1.2.5 油脂產率的測定

所有藻液進行離心(6 000 r/min，10 min)，藻泥經純水反復洗滌3～5次后收集至50 mL離心管中冷凍干燥，獲得的凍干藻粉使用甲醇-氯仿法[15]提取油脂。按下式計算油脂產率(y)。

y=m/m0×100%

(4)

式中：m為藻油質量;m0為凍干藻粉質量。

1.2.6 脂肪酸組成分析

根據Lepage等[16]的方法進行脂肪酸甲酯(FAMEs)的分析。氣相色譜條件為： DB-5 ms毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為N2，進樣口溫度和檢測器溫度分別為250℃和290℃；初始柱溫120℃，保持3 min，然后以4℃/min的速率升至220℃，保持5 min，再以3℃/min的速率升至280℃，保持20 min；進樣量1 μL。

1.2.7 數據分析

實驗數據用SPSS 13.0進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，并用LSD法進行多重比較，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同氮、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長及最大比生長速率

不同氮源、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長曲線如圖1所示。

圖1 不同氮、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長曲線

由圖1可以看出，NaNO3、NaNO2和CO(NH2)2作為氮源時，斜生柵藻藻密度隨著培養(yǎng)時間延長而顯著增加(P<0.05)，而NH4Cl作為氮源時，斜生柵藻的藻密度隨時間延長變化不顯著(P>0.05)。相同氮源環(huán)境中，NaNO3與3種碳源組合培養(yǎng)時斜生柵藻藻密度在整個培養(yǎng)過程中差異不顯著(P>0.05)；以NaNO2為氮源時，在斜生柵藻生長至穩(wěn)定期后(14～15 d)，Y2組藻密度顯著高于Y1和Y3組(P<0.05)；CO(NH2)2作氮源時，3種碳源對斜生柵藻藻密度影響較大，培養(yǎng)至對數期后藻密度由大到小依次為N1>N3>N2，并呈顯著差異(P<0.05)。

對12組處理的最大比生長速率(μmax)進行計算，可知在培養(yǎng)的2～4 d，斜生柵藻μmax均達到最大，具體見圖2。從圖2可以看出： N1、N3組μmax分別為(0.633±0.003)、(0.630±0.031) d-1，顯著高于其他10組(P<0.05)；μmax最低值出現在L2和L3組，僅為(0.214±0.003)、(0.234±0.003) d-1，均顯著低于其他各組(P<0.05)。

注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同氮、碳源組合培養(yǎng)對斜生柵藻葉綠素a含量及最大光量子產率的影響

培養(yǎng)至對數期中段(培養(yǎng)8 d)斜生柵藻葉綠素a含量及Fv/Fm變化如圖3所示。

注：不同大寫字母表示組間葉綠素a含量差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示組間Fv/Fm差異顯著(P<0.05)。

從圖3可以看出，NH4Cl作為氮源顯著降低了斜生柵藻葉綠素a的含量(P<0.05)，但Na2CO3作為碳源時，葉綠素a含量高于CH3COONa和C6H12O6處理。另外3種氮源中，CO(NH2)2處理后的斜生柵藻葉綠素a含量整體較高，其中N1組葉綠素a含量達到4.76 mg/L，顯著高于其他各組(P<0.05)，而在NaNO3和NaNO2處理組中斜生柵藻葉綠素a含量差異不大。

Fv/Fm表示PSⅡ最大光化學效率，指所有PSⅡ反應中心處于開放狀態(tài)時的量子產量，反映PSⅡ的功能，一般而言，該指標較為穩(wěn)定，但當處于脅迫環(huán)境時，Fv/Fm會顯著降低。本研究發(fā)現：12組處理中斜生柵藻Fv/Fm受到NH4Cl的影響更為突出，L1、L2和L3組Fv/Fm均小于0.60，可見NH4Cl對斜生柵藻具有一定的脅迫效應，使得斜生柵藻光合作用受到顯著抑制；當氮源為CO(NH2)2時，斜生柵藻平均Fv/Fm均高于其他3個氮源組。另外還發(fā)現，碳源為Na2CO3時，斜生柵藻Fv/Fm均高于同種氮源中其他兩種碳源的處理。

2.3 不同氮、碳源組合條件下斜生柵藻的油脂產率及脂肪酸組成

不同氮源、碳源組合處理下，生長至穩(wěn)定期末(培養(yǎng)15 d)斜生柵藻的油脂產率如圖4所示。

注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

從圖4可以看出，所有處理組中斜生柵藻油脂產率在15.80%～23.14%之間。其中，NH4Cl環(huán)境中斜生柵藻油脂產率均值僅為15.94%，顯著低于其他各組(P<0.05)；油脂產率最高的兩組為Y2和N1，分別為21.54%和23.14%，顯著高于其他各組(P<0.05)?？梢?，所有處理中NaNO3和NaNO2為氮源且C6H12O6作為碳源時，斜生柵藻更容易積累油脂，不同的是，CO(NH2)2環(huán)境中，添加Na2CO3使得斜生柵藻油脂產率最高。

表2為斜生柵藻油脂脂肪酸組成及相對含量。

表2 不同處理組斜生柵藻油脂脂肪酸組成及相對含量 %

續(xù)表2%

從表2可以看出，脂肪酸組成中飽和脂肪酸C16∶0(棕櫚酸)、單不飽和脂肪酸C18∶1(油酸)和多不飽和脂肪酸C18∶2(亞油酸)3者之和占總脂肪酸含量的87.63%～93.02%。其中，飽和脂肪酸C16∶0相對含量在19.61%～35.80%之間，單不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1含量在47.79%～66.91%之間，多不飽和脂肪酸C18∶2相對含量在5.74%～12.26%之間。

2.4 討論

Berman[8]研究表明，自然界氮源種類豐富，包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、氮氣、尿素、腐殖質、氨基酸等。然而，除少數固氮藍藻能固定利用大氣中的氮氣外，更多的藻類必須從外界環(huán)境中攝取化合態(tài)氮源來滿足自身所需，同時不同藻對氮源種類的需求存在很大差異[17-18]。馬紅芳等[19]研究發(fā)現柵藻LX1在養(yǎng)殖廢水中能夠優(yōu)先利用氨氮，再依次利用硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。胡章喜等[20]指出NaNO3是葡萄藻生長及油脂積累的理想氮源。在微藻培養(yǎng)過程中加入適量相應碳源，有助于提高微藻生長的密度。在生活污水培養(yǎng)時補充碳源Na2CO3、NaHCO3和CO2時，柵藻LX1生長及油脂積累特性與對照組無顯著差異[21]；在兼性培養(yǎng)時，碳源甘油、葡萄糖和乙酸鈉均支持三角褐指藻的生長并提高生物量的積累[22]。本研究發(fā)現，CO(NH2)2使得斜生柵藻生長狀況相對較好，藻密度、葉綠素a含量及Fv/Fm均較高，而NH4Cl不利于斜生柵藻的生長，原因可能是藻優(yōu)先對銨態(tài)氮的利用導致培養(yǎng)基pH迅速降低阻礙了生長[23]。NaNO3、NaNO2和NH4Cl為氮源時，3種碳源對斜生柵藻生長的影響不顯著(P>0.05)，然而在CO(NH2)2環(huán)境中，Na2CO3的添加使得斜生柵藻生物量顯著高于其他兩組(P<0.05)，相應地葉綠素a含量、Fv/Fm在所有組別中均為最高。說明在不同氮、碳源的組合中，CO(NH2)2和Na2CO3更有利于斜生柵藻的生長。

為使微藻能夠積累更多油脂，嘗試使用不同氮源、碳源培養(yǎng)成為可行的方案。王立柱等[24]研究表明，NaNO3是Chorellavulgaris積累油脂的最優(yōu)氮源；竇曉等[25]發(fā)現NaNO3對眼點擬微綠球藻油脂積累的影響較大，同時NaHCO3是其積累油脂的最優(yōu)碳源。本研究結果表明，當氮源為CO(NH2)2，碳源為Na2CO3時斜生柵藻油脂產率最高(23.14%)，同時NaNO2和C6H12O6組合中斜生柵藻油脂產率也可達到21.54%。可見從單一碳源角度，無論Na2CO3作為碳源時的自養(yǎng)還是C6H12O6作為碳源時的兼養(yǎng)均能使得斜生柵藻生長良好并積累較多的油脂。Knothe[26]研究表明，單不飽和脂肪酸更適合生產生物柴油，制備生物柴油的油脂原料中，C18∶1是重要組成之一，可以使生物柴油具有良好的低溫流動性能，并可有效減緩或降低多不飽和脂肪酸易氧化特性。油脂成分中擁有較長的碳直鏈且無碳支鏈，盡可能少的雙鍵并含一定量氧元素，且不含有芳香烴結構時[27]可作為理想的生物柴油原料。本研究中不同氮源、碳源組合培養(yǎng)后斜生柵藻脂肪酸以飽和脂肪酸C16∶0(棕櫚酸)、單不飽和脂肪酸C18∶1(油酸)和多不飽和脂肪酸C18∶2(亞油酸)為主，三者之和占總脂肪酸的87.63%～93.02%。其中，飽和脂肪酸C16∶0相對含量在19.61%～35.80%之間，單不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1相對含量在47.79%～66.91%之間，多不飽和脂肪酸C18∶2相對含量在5.74%～12.26%之間。培養(yǎng)基中氮源種類能影響微藻脂肪酸比例[23]，本研究中，NH4Cl作為氮源時，斜生柵藻油酸含量在62.13%～64.56%之間，顯著高于其他處理組(P<0.05)，但該條件不利于斜生柵藻生物量的積累；而油脂產率最高的兩個處理組N1和Y2油酸含量分別為57.92%和57.81%，相比其他組均處于較高水平。可見從脂肪酸組成及相對含量看，斜生柵藻積累的油脂符合生物柴油的要求，同時在生物量積累和油脂產率方面，CO(NH2)2和Na2CO3可作為斜生柵藻生產生物柴油的理想氮源和碳源。

3 結 論

本研究對比了4種常見氮源和3種常見碳源進行兩兩組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長、光合、油脂產率及脂肪酸組成。結果表明，NH4Cl不利于斜生柵藻的生長。NaNO3、NaNO2和NH4Cl分別為氮源時，3種碳源對斜生柵藻生長的影響不顯著，而在尿素環(huán)境中，Na2CO3的添加使得斜生柵藻生物量顯著高于其他兩組(P<0.05)。同時，12組處理中，CO(NH2)2和Na2CO3組合、NaNO2和C6H12O組合培養(yǎng)斜生柵藻時油脂產率最高，分別占細胞干重的23.14%和21.54%，且單不飽和脂肪酸油酸含量分別達57.92%和57.81%。因此，無論從生物量的積累還是油脂產率看，CO(NH2)2和Na2CO3可作為斜生柵藻生產生物柴油的理想氮、碳源。然而，本文中的CO(NH2)2和Na2CO3的含量都相對充足，因此通過控制其含量來獲得更高的生物量及油脂產率有待進一步研究。