楊宋琪，魏喜紅，王麗娟，楊生輝，羅光宏

(1.河西學(xué)院 甘肅省微藻工程技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000；2.西南大學(xué) 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

微藻因生長(zhǎng)周期短、繁殖速率快、油脂含量高、無(wú)污染以及培養(yǎng)不占耕地等特點(diǎn)，在眾多生物質(zhì)能源原料中備受關(guān)注[1]。斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)是廣泛分布于河、湖、庫(kù)、塘、土壤等生境的一種綠藻，容易分離純化獲得。近年來(lái)，斜生柵藻因其相對(duì)較高的油脂產(chǎn)率而被廣泛研究[2-5]。研究表明，斜生柵藻油脂組成以C16、C18系脂肪酸為主，且油脂含量占干重的11%～55%[6]，適宜于生產(chǎn)生物柴油。

氮是藻類生長(zhǎng)必需的元素之一，是蛋白質(zhì)和葉綠素等物質(zhì)的重要組成部分，對(duì)藻類生長(zhǎng)、繁殖等生理活動(dòng)有著重要的作用[7]。自然界中，藻類可利用硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、氮?dú)?、尿素等作為必需氮源[8]。培養(yǎng)過(guò)程中，氮源的選擇以及濃度的變化可以顯著影響藻的生長(zhǎng)速率、光合、油脂的積累及成分組成[9]。碳元素約占藻細(xì)胞干重的50%，是藻細(xì)胞的主要組成部分[10]，也是保證藻細(xì)胞大量積累油脂的必要條件[11]。碳源作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被藻類利用進(jìn)行有機(jī)物的合成和代謝產(chǎn)物的積累，一些藻類可以利用不同外加碳源進(jìn)行自養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)并顯著提升生物量和油脂產(chǎn)率[12]，小球藻亦可利用不同無(wú)機(jī)碳進(jìn)行快速生長(zhǎng)并顯著提升油脂產(chǎn)率[13]。

目前，許多學(xué)者集中在單一氮、碳、磷營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)微藻油脂積累的影響研究，而針對(duì)不同氮、碳源組合培養(yǎng)探究藻類生長(zhǎng)及油脂產(chǎn)率的研究較少。因此，本研究以斜生柵藻為研究材料，為獲得其適宜的氮源與碳源組合培養(yǎng)條件，選取4種常見(jiàn)氮源和3種不同形式碳源兩兩組合進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，對(duì)其生長(zhǎng)、光合、油脂產(chǎn)率及油脂脂肪酸組成進(jìn)行比較分析，為斜生柵藻生物量和油脂積累條件的篩選提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)FACHB-416，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù)。培養(yǎng)基所用氮源為尿素、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨，碳源為碳酸鈉、葡萄糖和乙酸鈉。

DR6000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)哈希)，植物效率分析儀(英國(guó)漢莎科技有限公司)，BT48冷凍干燥機(jī)(Millrock)，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，氮吹儀，GC-2014C氣相色譜(日本島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

根據(jù)表1將4種氮源和3種碳源兩兩組合，并以BG-11培養(yǎng)基氮、碳含量為依據(jù)分別進(jìn)行相應(yīng)氮、碳源的添加，共計(jì)12組。首先將斜生柵藻擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再將藻液進(jìn)行離心、洗滌，并轉(zhuǎn)接至無(wú)氮、無(wú)碳培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)3 d。饑餓培養(yǎng)后的藻離心收集后分別接入1.5 L含有不同氮、碳源培養(yǎng)基的柱狀反應(yīng)器中，初始藻密度(OD680)為0.1。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s)，光暗比12 h∶12 h，培養(yǎng)期間每天定時(shí)攪動(dòng)藻液3次。

表1 斜生柵藻培養(yǎng)的不同氮、碳源含量及編號(hào)

1.2.2 生長(zhǎng)曲線及比生長(zhǎng)速率

每24 h測(cè)定培養(yǎng)藻液的OD680，制作斜生柵藻生長(zhǎng)曲線。

比生長(zhǎng)速率計(jì)算公式為：

(1)

μmax=max(μ1,μ2,μ3,…μn)

(2)

式中：μ為斜生柵藻在某一時(shí)間段內(nèi)的比生長(zhǎng)速率；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；x2為t2時(shí)間的藻類生物量；x1為t1時(shí)間的藻類生物量。

1.2.3 葉綠素a含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]方法，各取5 mL的藻液進(jìn)行離心(7 000 r/min，10 min)，去除上清液后的藻細(xì)胞用90%的丙酮在4℃條件下黑暗提取24 h，提取液定容至10 mL后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定663、645 nm處吸光值。葉綠素a含量(C)按下式計(jì)算。

C=(8.02OD663+20.21OD645)

(3)

1.2.4 最大光量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的測(cè)定

取對(duì)數(shù)期藻液2.3 mL暗適應(yīng)20 min后，采用植物效率分析儀測(cè)定斜生柵藻最大光量子產(chǎn)率(Fv/Fm)，測(cè)定光強(qiáng)為3 000 μmol/(m2·s)，最大激發(fā)波長(zhǎng)為650 nm。

1.2.5 油脂產(chǎn)率的測(cè)定

所有藻液進(jìn)行離心(6 000 r/min，10 min)，藻泥經(jīng)純水反復(fù)洗滌3～5次后收集至50 mL離心管中冷凍干燥，獲得的凍干藻粉使用甲醇-氯仿法[15]提取油脂。按下式計(jì)算油脂產(chǎn)率(y)。

y=m/m0×100%

(4)

式中：m為藻油質(zhì)量;m0為凍干藻粉質(zhì)量。

1.2.6 脂肪酸組成分析

根據(jù)Lepage等[16]的方法進(jìn)行脂肪酸甲酯(FAMEs)的分析。氣相色譜條件為： DB-5 ms毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為N2，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度分別為250℃和290℃；初始柱溫120℃，保持3 min，然后以4℃/min的速率升至220℃，保持5 min，再以3℃/min的速率升至280℃，保持20 min；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，并用LSD法進(jìn)行多重比較，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長(zhǎng)及最大比生長(zhǎng)速率

不同氮源、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1 不同氮、碳源組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長(zhǎng)曲線

由圖1可以看出，NaNO3、NaNO2和CO(NH2)2作為氮源時(shí)，斜生柵藻藻密度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)，而NH4Cl作為氮源時(shí)，斜生柵藻的藻密度隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不顯著(P>0.05)。相同氮源環(huán)境中，NaNO3與3種碳源組合培養(yǎng)時(shí)斜生柵藻藻密度在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中差異不顯著(P>0.05)；以NaNO2為氮源時(shí)，在斜生柵藻生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后(14～15 d)，Y2組藻密度顯著高于Y1和Y3組(P<0.05)；CO(NH2)2作氮源時(shí)，3種碳源對(duì)斜生柵藻藻密度影響較大，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后藻密度由大到小依次為N1>N3>N2，并呈顯著差異(P<0.05)。

對(duì)12組處理的最大比生長(zhǎng)速率(μmax)進(jìn)行計(jì)算，可知在培養(yǎng)的2～4 d，斜生柵藻μmax均達(dá)到最大，具體見(jiàn)圖2。從圖2可以看出： N1、N3組μmax分別為(0.633±0.003)、(0.630±0.031) d-1，顯著高于其他10組(P<0.05)；μmax最低值出現(xiàn)在L2和L3組，僅為(0.214±0.003)、(0.234±0.003) d-1，均顯著低于其他各組(P<0.05)。

注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同氮、碳源組合培養(yǎng)對(duì)斜生柵藻葉綠素a含量及最大光量子產(chǎn)率的影響

培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中段(培養(yǎng)8 d)斜生柵藻葉綠素a含量及Fv/Fm變化如圖3所示。

注：不同大寫字母表示組間葉綠素a含量差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示組間Fv/Fm差異顯著(P<0.05)。

從圖3可以看出，NH4Cl作為氮源顯著降低了斜生柵藻葉綠素a的含量(P<0.05)，但Na2CO3作為碳源時(shí)，葉綠素a含量高于CH3COONa和C6H12O6處理。另外3種氮源中，CO(NH2)2處理后的斜生柵藻葉綠素a含量整體較高，其中N1組葉綠素a含量達(dá)到4.76 mg/L，顯著高于其他各組(P<0.05)，而在NaNO3和NaNO2處理組中斜生柵藻葉綠素a含量差異不大。

Fv/Fm表示PSⅡ最大光化學(xué)效率，指所有PSⅡ反應(yīng)中心處于開(kāi)放狀態(tài)時(shí)的量子產(chǎn)量，反映PSⅡ的功能，一般而言，該指標(biāo)較為穩(wěn)定，但當(dāng)處于脅迫環(huán)境時(shí)，F(xiàn)v/Fm會(huì)顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)：12組處理中斜生柵藻Fv/Fm受到NH4Cl的影響更為突出，L1、L2和L3組Fv/Fm均小于0.60，可見(jiàn)NH4Cl對(duì)斜生柵藻具有一定的脅迫效應(yīng)，使得斜生柵藻光合作用受到顯著抑制；當(dāng)?shù)礊镃O(NH2)2時(shí)，斜生柵藻平均Fv/Fm均高于其他3個(gè)氮源組。另外還發(fā)現(xiàn)，碳源為Na2CO3時(shí)，斜生柵藻Fv/Fm均高于同種氮源中其他兩種碳源的處理。

2.3 不同氮、碳源組合條件下斜生柵藻的油脂產(chǎn)率及脂肪酸組成

不同氮源、碳源組合處理下，生長(zhǎng)至穩(wěn)定期末(培養(yǎng)15 d)斜生柵藻的油脂產(chǎn)率如圖4所示。

注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

從圖4可以看出，所有處理組中斜生柵藻油脂產(chǎn)率在15.80%～23.14%之間。其中，NH4Cl環(huán)境中斜生柵藻油脂產(chǎn)率均值僅為15.94%，顯著低于其他各組(P<0.05)；油脂產(chǎn)率最高的兩組為Y2和N1，分別為21.54%和23.14%，顯著高于其他各組(P<0.05)?？梢?jiàn)，所有處理中NaNO3和NaNO2為氮源且C6H12O6作為碳源時(shí)，斜生柵藻更容易積累油脂，不同的是，CO(NH2)2環(huán)境中，添加Na2CO3使得斜生柵藻油脂產(chǎn)率最高。

表2為斜生柵藻油脂脂肪酸組成及相對(duì)含量。

表2 不同處理組斜生柵藻油脂脂肪酸組成及相對(duì)含量 %

續(xù)表2%

從表2可以看出，脂肪酸組成中飽和脂肪酸C16∶0(棕櫚酸)、單不飽和脂肪酸C18∶1(油酸)和多不飽和脂肪酸C18∶2(亞油酸)3者之和占總脂肪酸含量的87.63%～93.02%。其中，飽和脂肪酸C16∶0相對(duì)含量在19.61%～35.80%之間，單不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1含量在47.79%～66.91%之間，多不飽和脂肪酸C18∶2相對(duì)含量在5.74%～12.26%之間。

2.4 討論

Berman[8]研究表明，自然界氮源種類豐富，包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、氮?dú)?、尿素、腐殖質(zhì)、氨基酸等。然而，除少數(shù)固氮藍(lán)藻能固定利用大氣中的氮?dú)馔?，更多的藻類必須從外界環(huán)境中攝取化合態(tài)氮源來(lái)滿足自身所需，同時(shí)不同藻對(duì)氮源種類的需求存在很大差異[17-18]。馬紅芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)柵藻LX1在養(yǎng)殖廢水中能夠優(yōu)先利用氨氮，再依次利用硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。胡章喜等[20]指出NaNO3是葡萄藻生長(zhǎng)及油脂積累的理想氮源。在微藻培養(yǎng)過(guò)程中加入適量相應(yīng)碳源，有助于提高微藻生長(zhǎng)的密度。在生活污水培養(yǎng)時(shí)補(bǔ)充碳源Na2CO3、NaHCO3和CO2時(shí)，柵藻LX1生長(zhǎng)及油脂積累特性與對(duì)照組無(wú)顯著差異[21]；在兼性培養(yǎng)時(shí)，碳源甘油、葡萄糖和乙酸鈉均支持三角褐指藻的生長(zhǎng)并提高生物量的積累[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CO(NH2)2使得斜生柵藻生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好，藻密度、葉綠素a含量及Fv/Fm均較高，而NH4Cl不利于斜生柵藻的生長(zhǎng)，原因可能是藻優(yōu)先對(duì)銨態(tài)氮的利用導(dǎo)致培養(yǎng)基pH迅速降低阻礙了生長(zhǎng)[23]。NaNO3、NaNO2和NH4Cl為氮源時(shí)，3種碳源對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響不顯著(P>0.05)，然而在CO(NH2)2環(huán)境中，Na2CO3的添加使得斜生柵藻生物量顯著高于其他兩組(P<0.05)，相應(yīng)地葉綠素a含量、Fv/Fm在所有組別中均為最高。說(shuō)明在不同氮、碳源的組合中，CO(NH2)2和Na2CO3更有利于斜生柵藻的生長(zhǎng)。

為使微藻能夠積累更多油脂，嘗試使用不同氮源、碳源培養(yǎng)成為可行的方案。王立柱等[24]研究表明，NaNO3是Chorellavulgaris積累油脂的最優(yōu)氮源；竇曉等[25]發(fā)現(xiàn)NaNO3對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂積累的影響較大，同時(shí)NaHCO3是其積累油脂的最優(yōu)碳源。本研究結(jié)果表明，當(dāng)?shù)礊镃O(NH2)2，碳源為Na2CO3時(shí)斜生柵藻油脂產(chǎn)率最高(23.14%)，同時(shí)NaNO2和C6H12O6組合中斜生柵藻油脂產(chǎn)率也可達(dá)到21.54%?？梢?jiàn)從單一碳源角度，無(wú)論Na2CO3作為碳源時(shí)的自養(yǎng)還是C6H12O6作為碳源時(shí)的兼養(yǎng)均能使得斜生柵藻生長(zhǎng)良好并積累較多的油脂。Knothe[26]研究表明，單不飽和脂肪酸更適合生產(chǎn)生物柴油，制備生物柴油的油脂原料中，C18∶1是重要組成之一，可以使生物柴油具有良好的低溫流動(dòng)性能，并可有效減緩或降低多不飽和脂肪酸易氧化特性。油脂成分中擁有較長(zhǎng)的碳直鏈且無(wú)碳支鏈，盡可能少的雙鍵并含一定量氧元素，且不含有芳香烴結(jié)構(gòu)時(shí)[27]可作為理想的生物柴油原料。本研究中不同氮源、碳源組合培養(yǎng)后斜生柵藻脂肪酸以飽和脂肪酸C16∶0(棕櫚酸)、單不飽和脂肪酸C18∶1(油酸)和多不飽和脂肪酸C18∶2(亞油酸)為主，三者之和占總脂肪酸的87.63%～93.02%。其中，飽和脂肪酸C16∶0相對(duì)含量在19.61%～35.80%之間，單不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1相對(duì)含量在47.79%～66.91%之間，多不飽和脂肪酸C18∶2相對(duì)含量在5.74%～12.26%之間。培養(yǎng)基中氮源種類能影響微藻脂肪酸比例[23]，本研究中，NH4Cl作為氮源時(shí)，斜生柵藻油酸含量在62.13%～64.56%之間，顯著高于其他處理組(P<0.05)，但該條件不利于斜生柵藻生物量的積累；而油脂產(chǎn)率最高的兩個(gè)處理組N1和Y2油酸含量分別為57.92%和57.81%，相比其他組均處于較高水平?？梢?jiàn)從脂肪酸組成及相對(duì)含量看，斜生柵藻積累的油脂符合生物柴油的要求，同時(shí)在生物量積累和油脂產(chǎn)率方面，CO(NH2)2和Na2CO3可作為斜生柵藻生產(chǎn)生物柴油的理想氮源和碳源。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)比了4種常見(jiàn)氮源和3種常見(jiàn)碳源進(jìn)行兩兩組合培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長(zhǎng)、光合、油脂產(chǎn)率及脂肪酸組成。結(jié)果表明，NH4Cl不利于斜生柵藻的生長(zhǎng)。NaNO3、NaNO2和NH4Cl分別為氮源時(shí)，3種碳源對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響不顯著，而在尿素環(huán)境中，Na2CO3的添加使得斜生柵藻生物量顯著高于其他兩組(P<0.05)。同時(shí)，12組處理中，CO(NH2)2和Na2CO3組合、NaNO2和C6H12O組合培養(yǎng)斜生柵藻時(shí)油脂產(chǎn)率最高，分別占細(xì)胞干重的23.14%和21.54%，且單不飽和脂肪酸油酸含量分別達(dá)57.92%和57.81%。因此，無(wú)論從生物量的積累還是油脂產(chǎn)率看，CO(NH2)2和Na2CO3可作為斜生柵藻生產(chǎn)生物柴油的理想氮、碳源。然而，本文中的CO(NH2)2和Na2CO3的含量都相對(duì)充足，因此通過(guò)控制其含量來(lái)獲得更高的生物量及油脂產(chǎn)率有待進(jìn)一步研究。