張喜峰，王鑫鑫，張青婷，羅光宏

(1.河西學院 生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000； 2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3.河西學院 甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅 張掖 734000)

油用牡丹籽粕為油用牡丹籽榨油后的副產(chǎn)品，通常被作為肥料或動物飼料。然而，油用牡丹籽粕含有蛋白質、芍藥苷、丹皮酚、低聚茋類化合物等生物活性成分[1-2]，多糖作為其最重要成分之一，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒、抗氧化和免疫調節(jié)的藥理活性[3-5]。因此，多糖的開發(fā)利用具有重要意義。傳統(tǒng)的水提法、酶提取法和堿提取法廣泛應用于植物多糖的提取[6-8]。水提法簡單，成本低，但效率不高。酶提取法需要苛刻的操作條件，增加了生產(chǎn)成本。雖然堿提取法能提高多糖的溶出率，但部分多糖可能會發(fā)生分解。因此，開發(fā)一種綠色、高效的多糖提取方法具有重要意義。

低共熔溶劑(DES)是由氫鍵受體(HBAs)和氫鍵供體(HBDs)按照一定摩爾比形成的混合物，也被稱為離子液體(ILs)類似物。除與ILs相似的性質外，DES還具有成本低、制備簡單、生物毒性低、生物降解性好等優(yōu)點[9-10]。因此，在萃取領域中，DES綠色溶劑替代了一些生物毒性高、生物降解性低的離子液體，廣泛應用于植物資源中多種有效成分的提取，如橄欖油渣中的酚類化合物[11]、槐花中的黃酮[12]、長春花中的花青素[13]等。

雙水相體系(ATPS)作為一種液-液萃取技術，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。目前，已形成了不同類型的ATPS，如PEG/鹽[14]、PEG/葡聚糖[15]、有機溶劑/鹽[16]、ILs/鹽水[17]、DES/鹽水和溫敏性聚合物/鹽[18]。與其他ATPS相比，溫敏性ATPS不僅保留了ATPS的特性，還可通過改變溫度實現(xiàn)ATPS的成相組分和目標化合物分離。環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物(EOPO)是一種溫敏性聚合物,在溫度誘導下可實現(xiàn)相分離。目前，基于EOPO的ATPS已廣泛應用于苦參堿[19]、食物中痕量環(huán)丙沙星[18]和天然產(chǎn)物中生物活性成分[20]的提取。

本文以制備的16種DES為提取劑，研究DES種類、含水量、固液比、提取溫度、提取時間對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，采用熱分離ATPS對油用牡丹籽粕多糖進行初步純化，研究EOPO相對分子質量、終質量分數(shù)和萃取溫度對多糖萃取效果的影響，通過溫度誘導相分離回收多糖和EOPO，并對多糖相對分子質量、組成等進行了分析測定，以期為多糖的深度開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油用牡丹籽粕，由甘肅牡丹園林工程有限公司提供，經(jīng)干燥、粉碎、過篩后備用。

芐基三正丙基氯化銨、氯化膽堿、甜菜堿、丙氨酸、尿素、乙二醇、乳酸、甘油、蘋果酸、乙酰丙酸、苯乙酸等，上海源葉生物科技有限公司；EOPO(相對分子質量分別為2 000、2 500、2 870，分別記為EOPO2000、EOPO2500、EOPO2870)，浙江綠科安化學有限公司；光譜純溴化鉀、葡萄糖標準品、苯酚、濃硫酸等，成都德斯特生物科技有限公司。

PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Scientific；V1100紫外可見分光光度計，上海美析儀器有限公司；GC-MS6800氣相色譜質譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司；GPC-IR高效凝膠滲透色譜儀，北京億路達機電設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DES的制備

參照文獻[21]方法，在80℃下，將一定摩爾比的氫鍵受體(HBAs)和氫鍵供體(HBDs)混合物加熱攪拌一定時間后獲得均勻透明的液體，即為DES。具體的HBAs與HBDs摩爾比及含水量為30%的DES黏度和pH如表1所示。

表1 DES的制備條件及產(chǎn)品指標

續(xù)表1

1.2.2 多糖的提取

取一定量油用牡丹籽粕粉，加入體積分數(shù)為90%的乙醇于索氏提取器，在70℃處理4 h，以除去大部分脂肪，脫脂后的殘渣在40℃干燥后得到脫脂油用牡丹籽粕粉。脫脂油用牡丹籽粕粉與一定含水量的DES按一定固液比混合，超聲處理一定時間后，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)Sevag法反復多次除蛋白，得多糖粗提液。按照式(1)計算多糖得率(y1)。

(1)

式中：C為粗提液多糖的質量濃度，mg/mL；V為粗提液的體積，mL；m為油用牡丹籽粕粉的質量，g。

1.2.3 多糖的EOPO/DES雙水相萃取

取1 mL多糖粗提液，加入一定量EOPO，充分混勻后靜置形成ATPs，其中上相為EOPO相，下相為DES相。按照式(2)計算多糖萃取率(y2)。

(2)

式中：C0和Cl分別為EOPO相和DES相多糖的質量濃度，mg/mL；V0和Vl分別為EOPO相和DES相的體積，mL。

1.2.4 多糖的回收

取1.2.3中EOPO相，置于70℃水浴以誘導形成兩相，上相主要為EOPO(可重復使用)，下相為富含多糖的水相，水相減壓濃縮、冷凍干燥后即得多糖(DES-P)。按照式(3)計算多糖回收率(y3)。

(3)

式中：Ct和Cb分別為上相和下相多糖的質量濃度，mg/mL；Vt和Vb分別為上相和下相的體積，mL。

1.2.5 多糖含量的測定

以葡萄糖為標準品采用苯酚硫酸法[4]測定多糖含量。

1.2.6 多糖理化特性測定

1.2.6.1 相對分子質量

參考Li等[22]的方法，在繪制相對分子質量校正標準曲線基礎上，采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對多糖的平均相對分子質量進行測定。

1.2.6.2 單糖組成

參考秦春青等[23]的方法測定多糖的單糖組成。

1.2.6.3 結構表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀對多糖結構進行表征。多糖用KBr粉末研磨并壓入一個直徑為1 mm的小球中，在400～4 000 cm-1進行測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Duncan多范圍試驗進行統(tǒng)計分析，p<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)中的誤差棒表示3次重復試驗的標準偏差。

2 結果與討論

2.1 油用牡丹籽粕多糖的DES提取

2.1.1 DES種類對多糖提取效果的影響

固定固液比1∶30、DES含水量30%、提取溫度50℃、提取時間40 min，研究16種DES對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結果如表2所示。

由表2可知，16種DES中，DES8具有最佳油用牡丹籽粕多糖提取效果(p<0.05)，這可能歸因于DES8具有相對較低的黏度和弱酸性。據(jù)報道，DES物理特性如溶解度、黏度、表面張力和極性等因素是影響DES提取效果的重要因素[24]，高黏度會阻礙目標化合物在溶液中的擴散，傳質效果弱[25]。此外，DES8中氫鍵供體乙二醇結構中含有兩個羥基，多糖與乙二醇之間的氫鍵相互作用更強，可以提高多糖得率。因此，選擇DES8作為提取劑進行后續(xù)研究。

表2 DES種類對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響 mg/g

2.1.2 DES含水量對多糖提取效果的影響

固定固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時間40 min，研究DES含水量對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結果如圖1所示。

圖1 DES含水量對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖1可知，隨著DES含水量由10%增加至50%，多糖得率呈逐漸增加趨勢(p<0.05)，當DES含水量繼續(xù)增加時，多糖得率逐漸下降?？赡苁且驗檫m量水的加入可降低DES的黏度，提高傳質效果，但含水量過大時會破壞HBAs、HBDs和多糖之間的氫鍵相互作用，導致DES的提取能力下降。因此，確定DES含水量為50%。

2.1.3 固液比對多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、提取溫度50℃、提取時間40 min，研究固液比對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結果如圖2所示。

圖2 固液比對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖2可知，在固液比1∶10～1∶30的范圍內，多糖得率隨固液比的增加而增加(p<0.05)，繼續(xù)增加固液比時，多糖得率變化不顯著(p>0.05)?？赡苁且驗楣桃罕容^小時，會導致提取量不足，固液比過大會導致浪費，甚至不利于提取。因此，確定固液比為1∶30。

2.1.4 提取溫度對多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取時間40 min，研究提取溫度對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖3可知，多糖得率隨著提取溫度的升高而增加，當提取溫度超過50℃后，多糖得率呈下降趨勢?？赡苁且驗檩^高的溫度可以加速分子的擴散，使細胞結構更易被破壞，促進多糖溶出，而過高的溫度可能引起熱敏性物質分解，影響其得率。因此，確定提取溫度為50℃。

2.1.5 提取時間對多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取溫度50℃，研究提取時間對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取時間對油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖4可知，多糖得率在20～40 min范圍內隨提取時間延長逐漸增加(p<0.05)，而后隨著提取時間的繼續(xù)延長而降低。此現(xiàn)象歸因于多糖在一定時間內溶出率提高，但過長的提取時間可能會破壞多糖的結構，降低其得率。因此，確定40 min為最佳的提取時間。

在以DES8為提取劑、DES含水量50%、固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時間40 min下按1.2.2進行多糖提取，測得多糖得率為96.58 mg/g。

2.2 EOPO/DES雙水相萃取多糖

2.2.1 EOPO相對分子質量對多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO使其在溶液中終質量分數(shù)為55%，在萃取溫度為45℃條件下，研究EOPO相對分子質量對多糖萃取效果的影響，結果見圖5。

圖5 EOPO相對分子質量對多糖萃取效果的影響

EOPO相對分子質量不同，其黏性也不同，從而影響雙水相體系成相能力。由圖5可知，在雙水相體系中，相對分子質量為2 500的EOPO形成的雙水相體系多糖萃取率最高，且與其他兩種相對分子質量的EOPO相比，具有顯著差異(p<0.05)，這歸因于EOPO的鏈長、極性和黏度共同影響雙水相萃取效果。因此，確定采用EOPO2500進行后續(xù)試驗。

2.2.2 EOPO2500終質量分數(shù)對多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入不同量的EOPO2500使其形成不同終質量分數(shù)，在萃取溫度為45℃條件下，研究EOPO2500終質量分數(shù)對多糖萃取效果的影響，結果見圖6。

圖6 EOPO2500終質量分數(shù)對多糖萃取效果的影響

由圖6可知，多糖萃取率隨著EOPO2500終質量分數(shù)逐漸增加而增加，當EOPO終質量分數(shù)為55%時，多糖萃取率達到最大。可能是因為較高質量分數(shù)的EOPO增加了多糖與EOPO間的接觸面積，促進多糖優(yōu)先分配在EOPO相。隨著EOPO終質量分數(shù)的繼續(xù)增加，多糖萃取率略有下降，可能是由于高質量分數(shù)下共聚物的熵效應和體積排阻效應的結果。另外，過高的質量分數(shù)導致其黏度較大，不利于多糖富集在EOPO相。因此，確定EOPO2500終質量分數(shù)為55%。

2.2.3 萃取溫度對多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO2500使其終質量分數(shù)為55%，研究萃取溫度對多糖萃取效果的影響，結果如圖7所示。

圖7 萃取溫度對多糖萃取效果的影響

由圖7可知，隨萃取溫度升高多糖萃取率增大，當萃取溫度超過45℃時，多糖萃取率呈下降趨勢。適當升高溫度可以降低黏度，加速目標化合物在兩相間的分布。但隨著萃取溫度不斷升高，EOPO相飽和度增加，多糖的自由空間減小，降低了多糖萃取率。同時，EOPO是一種溫度敏感性的聚合物，其濁點約在70℃[26]。當萃取溫度持續(xù)接近濁點時，EOPO與多糖分離，阻礙多糖進入EOPO相。因此，確定萃取溫度為45℃。

在EOPO/DES體系中，當EOPO2500終質量分數(shù)為55%、萃取溫度為45℃時，多糖萃取率最高，為89.56%。

2.3 多糖的回收率

按1.2.4回收多糖，測得多糖回收率為86.15%。

2.4 多糖化學組成和結構特征

經(jīng)測定，DES-P的純度為76.59%，蛋白質含量為1.29%。結果表明，采用DES雙水相提取油用牡丹籽粕多糖是一種有效的提取方法。

由HPGPC測定的DES-P的相對分子質量分布如圖8所示。由圖8可知，DES-P由兩個對稱的峰組成，表明二者屬于不同種類。由校正曲線建立的回歸方程為logMw=-0.341 1X+9.894 2(Mw為平均相對分子質量，X為洗脫時間)，相關系數(shù)(R2)為0.992 9。根據(jù)該方程計算DES-P的兩個對稱峰平均相對分子質量分別為67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)。

圖8 DES-P相對分子質量分布

DES-P的總離子流圖如圖9所示，通過與單糖標準品的保留時間進行比較，確定DES-P主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾比為1∶2.5∶0.78。

圖9 DES-P的總離子流圖

DES-P的紅外光譜譜圖如圖10所示。由圖10可知：在3 424、2 921 cm-1處的強吸收峰歸因于O—H和C—H的拉伸振動；1 643、1 414 cm-1左右吸收峰歸因于羧基和羰基的存在；1 000～1 200 cm-1吸收峰表明DES-P存在C—O—C和C—O—H；855 cm-1左右吸收峰歸因于多糖中β-糖苷鍵。

圖10 DES-P紅外光譜圖

3 結 論

在本研究中，構建了一種基于溫度敏感性低共熔溶劑雙水相萃取分離油用牡丹籽粕多糖的方法，采用DES(氯化膽堿-乙二醇)作為最佳提取劑，當其含水量50%，固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時間40 min時，多糖得率為96.58 mg/g。隨后，采用EOPO/DES雙水相萃取分離多糖，當EOPO2500終質量分數(shù)為55%、萃取溫度為45℃時，多糖在EOPO相萃取率為89.56%；將EOPO相在70℃水浴進行溫度誘導分相，實現(xiàn)了多糖的回收，回收率為86.15%；所制備的多糖(DES-P)的平均相對分子質量分別為67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)，由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，三者摩爾比為1∶2.5∶0.78。溫敏性低共熔溶劑雙水相體系ATPS具有環(huán)境友好、萃取能力強、操作簡單、效率高、組分便于回收等特性，可作為多糖萃取分離的有效方法。