姚 芹，張 帥，王廣通，張 強(qiáng)

(蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇省食品安全快速檢測工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇省高等職業(yè)教育產(chǎn)教深度融合實(shí)訓(xùn)平臺(tái)，江蘇 蘇州 215008)

近年來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題日益受到全世界的關(guān)注。我國進(jìn)口大豆絕大部分都是轉(zhuǎn)基因大豆，且主要用于榨油，因此大豆油的轉(zhuǎn)基因成分檢測十分重要[1]。Nikolic等[2]用CTAB法和試劑盒法提取大豆毛油DNA，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增檢測，但CTAB法提取的DNA純度不高，試劑盒法費(fèi)用較高。而NY/T 674—2003《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 DNA提取和純化》中用有機(jī)溶劑反復(fù)抽提，去除蛋白質(zhì)、多糖和酚類，但有機(jī)溶劑用量較大。二氧化硅微粒是一種微吸附劑，具有吸附富集核酸的特性，近年來改性二氧化硅或磁性二氧化硅在高分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于提取DNA和RNA，且效果較好[3-6]。劉玲玲[7]、林霞[8]利用具有兩性離子的賴氨酸對(duì)二氧化硅表面進(jìn)行修飾，通過直接靜電作用提高DNA在介質(zhì)表面的吸附效率，或制備出可有效結(jié)合DNA的基因載體。鄭昆等[9]采用共沉淀法合成氨基化介孔二氧化硅納米材料，該材料能有效地吸附和保護(hù)質(zhì)粒DNA。因此，本文利用氨基化二氧化硅顆粒富集大豆及大豆油中DNA，測定大豆毛油及精煉油中轉(zhuǎn)基因成分，同時(shí)考察大豆油生產(chǎn)過程中DNA濃度和片段長度變化情況。本方法基本不涉及有機(jī)溶劑，且可有效富集DNA，為油脂中轉(zhuǎn)基因成分的檢測提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

含CaMV35s啟動(dòng)子、CP4EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆，阿根廷；轉(zhuǎn)基因壓榨大豆毛油、轉(zhuǎn)基因一級(jí)精煉大豆油，江蘇省南通榮豐油廠提供。氨基化二氧化硅，購于杭州新越生物技術(shù)有限公司，粒徑500 nm，使用時(shí)以無水乙醇分散，固體含量2.5%；PCR Mix(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反應(yīng)緩沖液)、DNA Ladder，上海生工生物工程有限公司；引物(見表1)，金唯智生物科技有限公司。

表1 引物名稱、序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀，Mastercycler ep Eppendorf 中國有限公司；Biorad GelDoc XR 伯樂凝膠成像系統(tǒng)，美國。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

裂解液：TNE緩沖液中加入SDS至終質(zhì)量濃度為5～20 μg/mL，pH為8.0。

結(jié)合液：將6.06 g Tris和5.84 g EDTA溶于水中，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5，加入591 g的異硫氰酸胍(GuSCN)溶于溶液中，再加入10 mL Triton-X100，用水定容至1 000 mL。溶液組分的終濃度為Tris-HCl 50 mmol/L、EDTA 20 mmol/L、GuSCN 5 mol/L、Triton-X100 1%溶液，pH為6.5。

洗液1：稱取1.46 g NaCl和6.06 g Tris溶于水中，并用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.4，再加入591 g的GuSCN溶于溶液中，用水定容至1 000 mL。溶液組分的終濃度為GuSCN 5 mol/L、NaCl 25 mmol/L、Tris-HCl 50 mmol/L、pH為6.4。

洗液2：稱取7.3 g NaCl和1.21 g Tris溶于水中，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，加水定容至1 000 mL，將無水乙醇用此溶液配制成體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液。

1.2.2 國標(biāo)法提取大豆毛油DNA

參照NY/T 674—2003 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 DNA提取和純化》進(jìn)行。具體為取大豆毛油30 mL放入100 mL離心管中，加入25 mL正己烷，振蕩混合2 h后，加入25 mL CTAB提取緩沖液，繼續(xù)振蕩混合2 h。10 000g離心10 min，取水相，加入等體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20℃下靜置1 h，10 000g離心10 min。取沉淀用400 μL TE緩沖液溶解后，加入200 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，輕緩顛倒混勻，10 000g離心2 min。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，加入等體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20℃下靜置1 h，10 000g離心10 min。取沉淀用1 mL 70%乙醇溶液洗滌，倒出上清。沉淀干燥，得大豆毛油DNA，將其溶解于100 μL TE緩沖液中，待測。

1.2.3 氨基化二氧化硅法提取大豆及大豆油中的DNA

大豆的預(yù)處理：大豆洗凈，液氮研磨成糊狀。

大豆毛油及精煉油的預(yù)處理：取200 mL大豆油，與20 mL TE緩沖液混合，常溫下置于磁力攪拌器上攪拌混勻30 min，將混合液移至分液漏斗中靜置，待分層后取下層水相。

取3支2 mL EP管分別加入預(yù)處理后的大豆20 mg、大豆毛油300 μL、精煉油300 μL，各加300 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，渦旋振蕩搖勻后，65℃水浴60 min。裂解后以12 000g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入500 μL結(jié)合液，再加入氨基化二氧化硅乙醇分散液30 μL，振蕩后放置室溫20 min。將離心管5 000g離心2 min，棄上清。加洗液1，并使氨基化二氧化硅顆粒充分懸浮，10 000g以上離心20 s，棄上清。加洗液2并使氨基化二氧化硅顆粒充分懸浮，10 000g以上離心20 s，棄上清，重復(fù)洗滌1次。10 000g以上離心20 s，移去殘留液體，室溫晾干。加入30 μL TE緩沖液，振蕩混勻后65℃溫育5 min，12 000g離心2 min，上清移至新的EP管中備用。

1.2.4 DNA的定量分析

取20 μL DNA提取液稀釋100倍，紫外分光光度計(jì)測定其260、280 nm吸光值，計(jì)算OD260/OD280比值，以1個(gè)OD260相當(dāng)于50 μg/mL DNA計(jì)算DNA質(zhì)量濃度。DNA質(zhì)量濃度=50×OD260×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 DNA體外擴(kuò)增反應(yīng)體系構(gòu)建及反應(yīng)條件

采用25 μL反應(yīng)體系，在PCR管中依次加入雙蒸水 10.5 μL， PCR Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA模板1 μL。熱循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，各條帶不同的退火溫度低溫退火30 s，72℃延伸45 s，Lectin-1、CP4EPSPS-1片段擴(kuò)增為40個(gè)循環(huán)，其余擴(kuò)增均為38個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基化二氧化硅法提取大豆DNA定量結(jié)果

按1.2.4方法測得大豆提取液的OD260/OD280比值為1.64，略低于1.7，說明本方法提取大豆DNA有少量蛋白質(zhì)污染，按公式計(jì)算得到氨基化二氧化硅法提取的大豆DNA樣品的DNA質(zhì)量濃度為86.5 μg/mL。

2.2 大豆毛油DNA提取定量結(jié)果

分別按1.2.2和1.2.3提取大豆毛油中DNA，按1.2.4方法測定OD260/OD280比值和DNA質(zhì)量濃度，得出國標(biāo)法提取大豆毛油OD260/OD280比值為1.82，DNA質(zhì)量濃度為6.45 μg/mL；氨基化二氧化硅法提取大豆毛油OD260/OD280比值為1.75，DNA質(zhì)量濃度為10.65 μg/mL。氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA的OD260/OD280比值略低于國標(biāo)法，但DNA質(zhì)量濃度比國標(biāo)法的高。此外，氨基化二氧化硅法提取的大豆毛油DNA質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于該法提取的大豆DNA的質(zhì)量濃度，這是因?yàn)閴赫ゲ⒉荒苁勾蠖怪蠨NA全部進(jìn)入油中，大部分DNA殘留在大豆餅粕中。

2.3 大豆毛油PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖1)

注：M.Marker；1.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-1；2.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-1；3.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-2；4.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-2；5.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-3；6.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-3；7.大豆毛油引物L(fēng)ectin-1；8.大豆毛油引物CP4EPSPS-1；9.大豆毛油引物L(fēng)ectin-2；10.大豆毛油引物CP4EPSPS-2；11.大豆毛油引物L(fēng)ectin-3；12.大豆毛油引物CP4EPSPS-3。

由圖1可以看出，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA用于大豆內(nèi)、外源基因擴(kuò)增，大豆毛油中1 500 bp左右的條帶和400 bp左右的條帶均未擴(kuò)增出來，這可能是因?yàn)閴赫ミ^程中料坯受到強(qiáng)大的壓力，壓榨溫度一般達(dá)到100～135℃，并且持續(xù)壓榨時(shí)，加熱與壓力的聯(lián)合作用，使蛋白質(zhì)變性，大豆DNA和蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成染色質(zhì)，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)解體會(huì)導(dǎo)致DNA片段的降解。但大豆毛油中擴(kuò)增到了118 bp的內(nèi)源基因片段和190 bp的外源基因片段，且條帶清晰。

2.4 大豆毛油轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件擴(kuò)增結(jié)果(見圖2)

注：M.Marker； 1.轉(zhuǎn)基因大豆引物CaMV35S；2.轉(zhuǎn)基因大豆引物NOS；3.大豆毛油引物CaMV35S；4.大豆毛油引物NOS。

由圖2可以看出，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA擴(kuò)增出了大豆外源基因調(diào)控元件，且條帶清晰。

2.5 精煉大豆油PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖3)

由圖3可以看出，氨基化二氧化硅法提取的精煉大豆油DNA，定性PCR未擴(kuò)增出大豆內(nèi)、外源基因條帶。這是由于精煉大豆油中DNA量甚微，需要高效的DNA富集技術(shù)結(jié)合靈敏度高的檢測方法如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR才能檢測[10-13]。說明氨基化二氧化硅法不適用于精煉大豆油DNA的提取。

注：M.Marker； 1.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-1；2.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-1；3.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-2；4.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-2；5.轉(zhuǎn)基因大豆引物L(fēng)ectin-3；6.轉(zhuǎn)基因大豆引物CP4EPSPS-3；7.精煉大豆油引物L(fēng)ectin-1；8.精煉大豆油引物CP4EPSPS-1；9.精煉大豆油引物L(fēng)ectin-2；10.精煉大豆油引物CP4EPSPS-2；11.精煉大豆油引物L(fēng)ectin-3；12.精煉大豆油引物CP4EPSPS-3。

3 結(jié) 論

(1)本研究以正電荷的氨基化二氧化硅顆粒為載體，富集大豆毛油中的DNA。和國標(biāo)法相比，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油中的DNA質(zhì)量濃度較高。

(2)氨基化二氧化硅法提取的大豆毛油DNA定性PCR擴(kuò)增出了內(nèi)、外源基因及外源基因調(diào)控元件的清晰條帶，而精煉油DNA未擴(kuò)增到內(nèi)、外源基因條帶。該方法只適用于大豆毛油的DNA提取，不適用于精煉油的DNA提取。