高佳慧，耿 建

（蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233030）

結核?。═B）是威脅人類健康的全球衛(wèi)生問題。隨著抗結核藥物的相繼問世，特別是兒童接種卡介苗后，結核病的發(fā)病率大幅度降低。但結核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)以及艾滋病發(fā)病率的增加使得結核病有“死灰復燃”之勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，也是全球27個耐多藥結核?。∕DRTB）高負擔國家之一[1]。耐藥結核的防治是我國亟待解決的難題。外泌體（exosomes）是機體大多數(shù)細胞能夠分泌的具有脂質雙層膜的納米級囊泡結構。外泌體可以激活多種細胞因子，并且作為巨噬細胞感染結核分枝桿菌后呈遞特異性抗原的載體[2]。另外，外泌體可以作為生物標志物和藥物載體在腫瘤的診斷與治療方面發(fā)揮作用[3]。外泌體對結核分枝桿菌的作用是開發(fā)抗結核感染疫苗的一個方向，更多的研究者瞄準該方向以探求更好的診斷和治療結核病的方法。本文就最新的相關成果進行總結并對外泌體對結核分枝桿菌的作用進行綜述。

1 外泌體

1.1 生物學特性

細胞外囊泡（EVs）是經(jīng)由旁分泌得到的納米級顆粒，主要包括外泌體（exosome）、微囊泡（microvesicle）、膜囊泡-凋亡小體（appoticbody）[4-7]，參與細胞間的信息交流。Théry 等[8]在 2018 年對其進行了更為準確的劃分，將細胞外囊泡直徑小于200 nm的稱為medium/large EVs，直徑小于100 nm的稱為small EVs。外泌體是一種直徑約為30～150 nm的微小的盤型囊泡。1983年，外泌體第一次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為exosome[9]。但在之前外泌體并沒有得到人們的重視，被看作是一種細胞廢棄物。因此，外泌體的相關結構與功能并未被挖掘。幾乎所有類型的細胞在正常和病理狀態(tài)下包括腫瘤細胞均可以分泌外泌體，其可以攜帶多種蛋白質、DNA、RNAs（微小RNA、環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA等）、脂質、轉錄因子等生物分子。外泌體作為這些物質的載體，是細胞與細胞之間傳遞生物信息的介質，在細胞間的通訊過程中起著重要的作用。作為一種天然載體，外泌體存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁，通過內體途徑形成主要來源于與溶酶體相關的多囊泡體，然后通過膜融合釋放到細胞外基質，見圖1。外泌體表面含有豐富的鞘磷脂、膽固醇等脂質類物質。外泌體中含有多種功能蛋白質，例如RAB蛋白、膜聯(lián)蛋白、熱休克蛋白家族（HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2、HSP90）以及 A33、MHC-Ⅱ、CD86、CD63、CD9等。某些外泌體蛋白質可以作為一種生物標志物在機體的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。外泌體的表面還含有與肺癌密切相關的隸屬于非編碼RNAs（ncRNAs）[10]的miRNA[11]。相關研究表明[12]，外泌體在低氧 TME（TME）內調解如癌細胞與基質細胞等各種細胞類型間的雙向信號轉導，在腫瘤侵入、血管生成、免疫逃避中起著重要作用。

1.2 外泌體的標記與分離

外泌體與腫瘤治療的相關性已經(jīng)成為當下的研究熱點之一。對外泌體的標記與分離是研究外泌體結構與功能的關鍵步驟。外泌體可以通過化學修飾、適體親和力、兩親性分子插入等方法進行標記。相關研究表明可以通過超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法等方法對外泌體進行分離[13]，也有研究提出利用微流控及外泌體膜的相關性質來實現(xiàn)對外泌體的分離[14]。近年來還出現(xiàn)了與外泌體相關的蛋白分析新方法，較為典型的有小顆粒流式細胞儀、微核磁共振等離子外泌體（nPLEX）傳感器和高敏感ExoScreen技術。另外，有相關研究創(chuàng)造性地提出了利用ExoTIC（外異性全隔離芯片）從癌癥患者臨床樣本中分離EVs，這種方法便捷易行具有廣泛的使用性。更有研究者提出構造人工囊泡（MIMV）來實現(xiàn)對外泌體的相關性研究。

圖1 外泌體參與細胞間信息交流的4種途徑[13]

2 結核分枝桿菌的生物學特性與耐藥機制

2.1 生物學特性

結核分枝桿菌（Mtb）是引起人類結核感染的最常見原因?？梢郧址父髌鞴?，其中呼吸道感染引起的肺結核最為常見。Mtb的致病物質與其菌體成分如莢膜、脂質和蛋白質有關，其中包括索狀因子、磷脂、硫酸腦苷脂、蠟質D在內的糖脂尤為重要。Mtb是一種胞內感染菌，機體對Mtb的免疫主要是以T淋巴細胞為主的細胞免疫。目前，臨床上通過結核菌素皮膚試驗、抗原檢測、分子生物學鑒定、抗結核抗體（lgG）檢測等方法進行鑒定。在最近的研究中，Cancino-Muoz I[15]等利用高分辨率的實時PCR、Sanger測序等技術鑒定了人和牛宿主的491個樣本，提出了SNP的方法來治療基因型結核分枝桿菌復合菌株。Shin S等[16]對用于檢測結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的GENEDIA MTB/NTM試劑盒的診斷性能進行了評估。

2.2 耐藥機制

近年來，結核病“死灰復燃”并在全球大范圍流行，還出現(xiàn)了耐藥菌株。WHO統(tǒng)計指出中國每年結核新發(fā)病例在90萬例左右，新發(fā)耐藥結核患者約5.8萬例[1]。結核病易感者及攜帶者是防治結核的重中之重。結核分枝桿菌的耐藥機制尚未研究透徹，而耐多藥結核病的出現(xiàn)無疑給Mtb研究者帶來新的挑戰(zhàn)。

合理的化學藥物治療是控制結核病發(fā)展、復發(fā)及抑制耐藥性產(chǎn)生的關鍵。目前用于臨床的一線抗結核藥包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇等。但隨著藥物的長期使用，新發(fā)耐多藥結核病層出不窮?？菇Y核藥的作用機理主要是通過阻礙結核分枝桿菌細胞壁、RNA以及蛋白質的合成，干擾結核分枝桿菌的生物代謝等來發(fā)揮作用。導致Mtb耐藥的主要原因之一是基因突變。有研究表明[17]，結核分枝桿菌對異煙肼耐藥的一個重要方面就是katG基因的突變。除此之外，inhA基因發(fā)生突變以及ndh等基因的突變也是引起異煙肼耐藥的重要原因。另外，相關研究指出rpob基因突變可以導致大約95%利福平耐藥菌株的出現(xiàn)，編碼阿拉伯糖基轉移酶的embABC操縱子基因突變可以導致Mtb對乙胺丁醇耐藥，而細胞壁滲透性下降也是Mtb耐藥的一個重要方面。另外研究[18]指出目前貝達喹啉、利奈唑胺、德拉馬尼是耐多藥結核的有效藥物。耐藥菌株的出現(xiàn)導致耐多藥結核病的發(fā)展迅猛，使得打贏結核病的防治攻堅戰(zhàn)更為艱難。

3 外泌體與結核分枝桿菌的相互作用

Mtb感染機體會激活機體相關的免疫應答。機體對Mtb的免疫主要是T淋巴細胞介導的細胞免疫。過往的研究指出在此細胞免疫中起到關鍵作用的是巨噬細胞。Smith等[19]研究發(fā)現(xiàn)被Mtb感染的小鼠巨噬細胞釋放的外泌體可以顯著影響T細胞應答。用BCG感染人單核細胞源性巨噬細胞（MDMs）可導致包括miR-155、miR-146a、miR-145 和 miR-21 在內的多種 miRNA的釋放，這些miRNA被預測是與免疫相關的重要靶向基因。

3.1 抗原提呈作用

巨噬細胞具有識別結核分枝桿菌的能力，同時巨噬細胞是結核分枝桿菌寄生的場所。巨噬細胞識別結核分枝桿菌主要通過Toll樣受體（TLR）進行，TLRs是跨膜蛋白受體，主要在單核巨噬細胞表面進行表達。另外，與巨噬細胞識別結核分枝桿菌相關的受體還包括NOD樣受體、C型凝集素受體等。結核分枝桿菌與機體巨噬細胞接觸被巨噬細胞吞噬后被細胞質膜包裹，與此同時巨噬細胞形成溶酶體，其內的溶菌酶、蛋白酶等物質可以將結核分枝桿菌的各種蛋白降解，得到易于轉運的短肽片段。此時，主要組織相容性復合物（MHC）合成MHCs來發(fā)揮提呈活性成分和抗原的功能。MHC-Ⅰ類及MHC-Ⅱ類分子[20]將這些短肽片段呈遞給巨噬細胞從而可以分別激活免疫系統(tǒng)的CD8+T、CD4+T淋巴細胞。其中CD4+T細胞所介導的免疫應答是主要的免疫應答。在進入內質網(wǎng)、高爾基體后，小分子被轉運到巨噬細胞表面，被CD8+T細胞識別。同時CD8+T細胞可以釋放穿孔素和顆粒酶，進行誘導靶細胞凋亡的機制Fas/FasL殺傷結核分枝桿菌。巨噬細胞在結核分枝桿菌的固有免疫系統(tǒng)中有重要的作用，例如TLR2[21]可以借助于其他的Toll樣受體識別結核分枝桿菌細胞壁的糖脂類成分以此來在固有免疫中發(fā)揮作用。此外，巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌利用胞內消化酶來殺傷結核桿菌，結核的感染可劃分為3個階段：無癥狀清除、潛伏感染、出現(xiàn)臨床疾病。

3.2 細胞因子

細胞因子[22]在T淋巴細胞介導的細胞免疫中扮演著重要角色。巨噬細胞在結核分枝桿菌和其他生物因子的作用下可以分泌多種細胞因子來調節(jié)抗原提呈作用。如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-12和IFN-γ等。TNF-α可以誘導巨噬細胞，通過抑制結核分枝桿菌的生長來介導抗結核免疫。IL-12在增強Th1型細胞免疫與特異性免疫關系中具有重要作用。IFN-γ、炎癥細胞因子參與了肺結核的感染免疫[23]。巨噬細胞分泌的外泌體可以阻礙天然巨噬細胞的INF-γ途徑的激活，抑制小鼠巨噬細胞表面MHCⅡ類和CD64分子的表達。另外，外泌體具有激活巨噬細胞、樹突狀細胞和初始CD4+T、CD8+T[24]細胞的能力?？乖碳ひ餋D4+T細胞活化，活化后的CD4+T細胞可以釋放細胞因子IFN-γ，它可以促進機體特異性地殺傷結核分枝桿菌，從而發(fā)揮保護性免疫來抗結核分枝桿菌的感染。巨噬細胞感染結核分枝桿菌后，可以產(chǎn)生羥自由基、過氧化氫和超氧陰離子等自由基。這些自由基可以破壞Mtb的核酸多糖導致DNA突變，從而抑制結核分枝桿菌的殺傷作用。除此之外，宋群等[25]選取33例耐藥肺結核、49例普通肺結核及51例健康志愿者展開對比，研究得出Th17/CD4+CD25+Foxp3+T平衡與結核病的發(fā)生與耐藥結核病的產(chǎn)生密切相關。另外有研究者[26]在實驗時將Mtb感染的Rab27a缺陷小鼠與野生型小鼠相比，發(fā)現(xiàn)其外泌體產(chǎn)量減少，抗原特異性T細胞激活就減少，控制Mtb感染的能力下降，從而可以看出外泌體對特異性T細胞免疫的影響。

4 外泌體疫苗的開發(fā)

如今廣泛用于治療結核病的疫苗的是卡介苗（BCGVaccine），是唯一獲得許可使用的減毒活疫苗[27]。研究表明，BCG的親本株為牛型分枝桿菌，失去了編碼毒力因子的RD1區(qū)。新生兒接種卡介苗很大程度降低了結核病的發(fā)病率，可以預防兒童結核性腦膜炎和播散性結核病，但不能預防成年人感染MTB。所以，對于目前防治結核病的狀況，需要進一步加強對抗結核感染藥物研發(fā)。目前，市場和臨床試驗的抗結核疫苗大致分為三類[28]：基礎性免疫疫苗、增強性免疫疫苗、TB治療疫苗。其中VPM 1002是BCG的一個重組株，研究者利用48例新生兒進行臨床試驗證實VPM1002在安全性和耐受性上有很好的效果。MTBVAC也是一種直接用于減毒的疫苗。相關的疫苗還包括Ad35/Aeras40、Hybrid 1-IC31、Ruti疫苗、SRL-172 疫苗、DAR-901等。隨著對外泌體研究的不斷深入，外泌體作為生物標志物和天然載體的功能在腫瘤治療、冠心病、感染性疾病的作用與日俱增。外泌體miR-21可以通過多種方式影響HCC細胞的生長，血漿miR-452[29]可以作為胃癌的生物標志物，外泌體miRNA可作為肺癌[11，30]診斷和預后判斷的生物標志物。這些都為我們研究外泌體抗結核感染的疫苗提供了方向。

有研究指出納米載體可向腫瘤細胞提供藥物用于腫瘤的藥物治療且外泌體的miRNAs[31]有成為癌癥診斷標志物的潛能。隨著對結核發(fā)病機理的深入研究，阻礙結核病的發(fā)病過程可降低結核病的發(fā)病率。納米載體無疑為治療結核病提供了一個研究方向，那就是作為藥物載體來輸送靶向藥物治療結核病，甚至是用于輸送核酸。Xu等[32]已成功開發(fā)出一種新的ROS響應性和腫瘤穿透性多前體藥物納米平臺，用于靶向癌癥治療。

5 展望

對于目前TB感染和防控的現(xiàn)狀，雖然存在抗結核的相關藥物并且臨床新藥物的研究也有所進展，但耐多藥結核菌株難保不會對這些藥物再次產(chǎn)生耐藥性。因此，需要進一步加強對MTB感染和抗MDR-TB的基礎研究，積極研制新型治療MDRTB患者的藥物。另外，結核分枝桿菌感染是引起艾滋?。ˋIDS）患者最常見的機會性感染和病死的原因[31，33]。但外泌體的研究還處于初級階段，并且Mtb逃避宿主細胞免疫監(jiān)視和清除機制尚未明確。雖然外泌體對腫瘤治療的作用研究有所進展，但外泌體抗結核感染疫苗的開發(fā)之路還很漫長。還有一點就是，相關的研究指出EV miRNA的分析還很欠缺[34]。