孫 鶯 ，王玉梅 ，何曉英 ，李 莉 ，牟建平 ，徐勤科 ，王亞麗 ，謝親建 ，楊平榮

（1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000；2.國(guó)家藥監(jiān)局中藥材及飲片質(zhì)量控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

中藥飲片是指藥材經(jīng)過(guò)炮制后可直接用于中醫(yī)臨床或制劑生產(chǎn)使用的處方藥品。中藥飲片質(zhì)量直接關(guān)系著臨床用藥的安全性、有效性[1]，微生物污染是飲片外源性污染的主要形式之一，也是影響人體健康的重要途徑[2]。藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施，因此，制定科學(xué)合理的中藥飲片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是保證飲片微生物安全的關(guān)鍵，也是實(shí)現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)引領(lǐng)國(guó)際、中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵[3]。目前，國(guó)外藥品標(biāo)準(zhǔn)如《歐洲藥典》《美國(guó)藥典》和《日本藥典》均收載了天然藥（生藥）的微生物檢查方法和限度標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》2015年版四部[4]通則“1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”首次收載了中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，但僅針對(duì)研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片規(guī)定了沙門(mén)菌和耐膽鹽革蘭陰性菌限度標(biāo)準(zhǔn)，暫未規(guī)定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)限度，更沒(méi)有其他中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致中藥飲片的衛(wèi)生質(zhì)量缺乏全面的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，使中藥飲片在應(yīng)用中存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，中藥飲片微生物污染情況比較嚴(yán)重，衛(wèi)生質(zhì)量亟待提高，微生物限度標(biāo)準(zhǔn)亟待完善[5-9]。甘肅是全國(guó)中藥材資源大省，素有“千年藥鄉(xiāng)”之稱(chēng)，特別是道地藥材種植已形成一定規(guī)模，本研究以3種甘肅道地藥材黃芪、甘草、板藍(lán)根中藥飲片為研究對(duì)象，每種飲片30批共計(jì)90批，考查微生物污染狀況，初步掌握微生物污染負(fù)載水平，為中藥飲片微生物污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和微生物標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

超凈工作臺(tái)（上海蘇凈，SW-CJ-2D）；生物安全柜（ESCD，ClassⅡBSC）；生化培養(yǎng)箱 （上海一恒，BPMJ-250F）；PCR 儀（ABI，Veriti）。

1.2 試劑

pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號(hào)：20191102）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號(hào)：20190930）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批號(hào)：20191212）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號(hào)：20190912）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基；RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基；木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）（批號(hào)：20181124）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）。均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 中藥飲片

本研究選取我省3種道地藥材品種黃芪、甘草、板藍(lán)根的中藥飲片，每個(gè)品種30個(gè)批次共計(jì)90批次。黃芪來(lái)源于甘肅、安徽、河北、陜西、四川的26個(gè)不同廠家；甘草來(lái)源于甘肅、安徽、北京23個(gè)不同廠家；板藍(lán)根來(lái)源于甘肅、安徽、河北、陜西、四川的26個(gè)不同廠家。

2 試驗(yàn)方法

參照《中國(guó)藥典》2015年版中“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則 1105）和“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”（通則1106）進(jìn)行檢查[9]。

2.1 供試品溶液的制備

稱(chēng)取10 g樣品，加入100 ml pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中，振蕩，制成1∶10供試品溶液。

2.2 需氧菌總數(shù)（TAMC）的測(cè)定

取“2.1”中1∶10供試液，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍稀釋至10-5，采用平皿法計(jì)數(shù)，1 mL/皿，平行制備2個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)5 d。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）的測(cè)定

取“2.1”中1∶10供試液，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍梯度稀釋至10-4，采用平皿法計(jì)數(shù)，1 ml/皿，平行制備2個(gè)平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)7 d。

2.4 控制菌的檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-tolerant Gram-negitive Bacteria，BGB） 取“2.1”中 1∶10 供試液，按照 2015 年版《中國(guó)藥典》四部通則“微生物計(jì)數(shù)法”[9]進(jìn)行耐膽鹽革蘭陰性菌的定量檢查和定性檢查。取10-1、10-2和10-3供試品稀釋液1 mL分別接種至10 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)48 h。取相當(dāng)于1 g樣品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至100 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h后，劃線(xiàn)接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)24 h。

2.4.2 沙門(mén)菌 取飲片樣品10 g，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃下培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)物0.1 mL接種至10 mL RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃下培養(yǎng)48 h。取少量RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃下培養(yǎng)48 h。

2.5 菌種鑒定

從“2.4.1”中的紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板和“2.4.2”中的木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板選取不同典型形態(tài)的微生物，進(jìn)行菌株的分離純化，PCR擴(kuò)增16s rRNA基因，以27F和1492R為引物，進(jìn)行16s rRNA片段擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序（通用生物測(cè)序），將所測(cè)得的16s rRNA基因序列用BLAST軟件進(jìn)行相關(guān)序列的對(duì)比，確定分離純化所得到的細(xì)菌的種屬。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

將需氧菌總數(shù)（TAMC）的結(jié)果取對(duì)數(shù)（以lgTAMC表示），分別以90批飲片樣品的lgTAMC值為橫坐標(biāo)、lgTAMC頻數(shù)為縱坐標(biāo)做直方圖和分布曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。以黃芪、甘草、板藍(lán)根各30批的飲片樣品的lgTAMC值為橫坐標(biāo)、lgTAMC頻數(shù)為縱坐標(biāo)做直方圖和分布曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2～4。本次試驗(yàn)所選取的90個(gè)批次中藥飲片均檢出需氧菌，lgTAMC的均值為3.573，最小值為2.021，最大值為5.989，見(jiàn)表1。由圖1可知，90批飲片樣品的lgTAMC值呈偏態(tài)分布。90批飲片樣品的lgTAMC值均小于6.0，整體水平符合歐洲、日本、美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)藥典與中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎狄?jiàn)表2。

表1 飲片樣品TAMC和TYMC測(cè)定結(jié)果

表2 各國(guó)藥典與中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎?/p>

由圖2～4可知，3種中藥飲片中，黃芪的需氧菌污染程度最高，板藍(lán)根需氧菌污染程度最低，其中黃芪中需氧菌總數(shù)最高值達(dá)106cfu/g。黃芪飲片樣品的lgTAMC值為2.021～5.035，甘草飲片樣品的 lgTAMC值為 2.114～5.106，板藍(lán)根飲片樣品的lgTAMC值為2.477～5.989，不同批次中藥飲片微生物污染情況各不相同，其中板藍(lán)根各批次間需氧菌總數(shù)差別尤為明顯，這種差別最高達(dá)3.5個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 所有飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖2 黃芪飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖3 甘草飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖4 板藍(lán)根飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線(xiàn)

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

將霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）的結(jié)果取對(duì)數(shù)（以lgTYMC表示），以90批飲片樣品的lgTYMC值為橫坐標(biāo)、lgTYMC頻數(shù)為縱坐標(biāo)做直方圖和分布曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。以黃芪、甘草、板藍(lán)根各30批的飲片樣品的lgTYMC值為橫坐標(biāo)、lgTYMC頻數(shù)為縱坐標(biāo)做直方圖和分布曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6～8。

90批飲片樣品均檢出霉菌和酵母菌，lgTYMC的均值為1.963，最小值為0.699，最大值為4.161，見(jiàn)表1。由圖5可知，lgTYMC值呈偏態(tài)分布，其中超過(guò)70%的lgTYMC值為0.5～1.5，超過(guò)99%的lgTYMC值小于4.0，符合美國(guó)、歐洲、日本藥典標(biāo)準(zhǔn)。全部飲片lgTYMC值小于5.0，整體水平符合歐洲、美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。只有1批板藍(lán)根lgTYMC值大于4.0，小于5.0，不符合《美國(guó)藥典》要求。由圖6～8可知，3種中藥飲片中，霉菌和酵母菌污染程度黃芪最高，板藍(lán)根最低，其中黃芪中霉菌和酵母菌最高值達(dá)104cfu/g。黃芪飲片樣品的lgTYMC值為1.000～3.161，甘草飲片樣品的 lgTYMC值為0.699～3.114，板藍(lán)根飲片樣品的lgTYMC值為0.699～4.161，不同批次中藥飲片微生物污染情況各不相同，其中板藍(lán)根各批次間霉菌和酵母菌數(shù)差異最大，質(zhì)量最不穩(wěn)定，這種差別最高達(dá)3.5個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖5 所有飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖6 黃芪飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖7 甘草飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線(xiàn)

圖8 板藍(lán)根飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線(xiàn)

3.3 控制菌測(cè)定結(jié)果

3.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 耐膽鹽革蘭陰性菌將N值進(jìn)行轉(zhuǎn)化，N＜10 轉(zhuǎn)化為 0.5，10＜N＜1×100 轉(zhuǎn)化為 1.5，1×100＜N＜1×1 000轉(zhuǎn)化為2.5，N＞1×1 000轉(zhuǎn)化為3.5，轉(zhuǎn)化數(shù)值做的直方圖和分布曲線(xiàn)見(jiàn)圖9。90批中藥飲片中，44批檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，占48.9%，其中黃芪17批，甘草20批，板藍(lán)根7批，分別占各自批數(shù)的56.7%、66.7%、23.3%。不同批次和來(lái)源的同種飲片耐膽鹽革蘭陰性菌差別很大。

圖9 所有飲片樣品耐膽鹽革蘭陰性菌直方圖和分布曲線(xiàn)

3.3.2 沙門(mén)菌檢測(cè) 經(jīng)檢驗(yàn)，90批飲片中檢出沙門(mén)菌2批，都是甘草飲片，不符合各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。沙門(mén)菌被認(rèn)為是目前世界范圍內(nèi)最重要的食源性致病菌之一，需要引起關(guān)注。

3.4 菌種鑒定結(jié)果

挑取平板上的典型菌落，16s rRNA鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。不同飲片品種中污染的微生物分布于4個(gè)科，8個(gè)屬。其中檢出比例最高的為腸桿菌科和芽孢桿菌科，其次為纖維桿菌科和乳桿菌科。不同飲片樣品中檢出的污染微生物種類(lèi)具有明顯的差異，板藍(lán)根中檢出4種典型污染菌，黃芪和甘草中各檢出3種典型污染菌。值得注意的是，從中藥飲片中檢出了陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌這些重要的條件致病菌，檢出芽孢桿菌屬和類(lèi)芽孢桿菌屬等耐熱微生物，這些細(xì)菌為環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌，可能在種植和生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)引入，而芽孢桿菌屬細(xì)菌較難殺滅。因此，對(duì)于一些沖泡或直接服用的飲片，存在一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)。

4 討論

4.1 中藥飲片微生物污染情況

甘肅省是中藥材資源大省，黃芪、甘草、板藍(lán)根為甘肅道地大宗中藥材，均屬于未經(jīng)炮制處理的藥材，需要煎煮服用。90批飲片需氧菌總數(shù)平均值高于103cfu/g，最大值達(dá)106cfu/g；霉菌及酵母菌總數(shù)平均值達(dá)到102cfu/g，最大值超過(guò)104cfu/g。耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率48.9%，檢出沙門(mén)菌2批，都是甘草飲片。黃芪的微生物污染程度最高，板藍(lán)根污染程度最低。按照《中國(guó)藥典》2015年版要求，不合格率為2.2%

4.2 基于微生物污染情況的建議

本研究發(fā)現(xiàn)飲片微生物負(fù)載水平較高，衛(wèi)生狀況欠佳，中藥飲片中污染的需氧菌和耐膽鹽革蘭陰性菌數(shù)量較大，雖然通過(guò)傳統(tǒng)的加工炮制方法如煎煮、熬制等能消除飲片中部分微生物對(duì)人體健康的直接威脅，但微生物的生長(zhǎng)代謝對(duì)中藥飲片的有效成分、藥效會(huì)帶來(lái)不可逆的轉(zhuǎn)變。因此，全面加強(qiáng)中藥飲片微生物污染的控制，是加強(qiáng)外源性污染物控制、提高中藥飲片臨床使用安全的重要工作之一。我國(guó)中藥飲片微生物標(biāo)準(zhǔn)與發(fā)達(dá)國(guó)家存在一定差距，嚴(yán)重制約中藥產(chǎn)業(yè)走向世界。基于本研究結(jié)果，建議進(jìn)一步開(kāi)展中藥飲片微生物危害的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，建議根據(jù)中藥飲片的入藥部位、藥性、炮制工藝等建立合理的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，引導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)過(guò)程控制，逐步規(guī)范中藥飲片生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)的各環(huán)節(jié)，降低微生物負(fù)荷和中藥飲片的安全風(fēng)險(xiǎn)，既可以加強(qiáng)藥品質(zhì)量安全，又能為促進(jìn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起到積極作用。

表3 菌種鑒定結(jié)果