熊青，陳勝輝，李恒

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，南昌 330004

補(bǔ)腎安胎顆粒是江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黨參、槲寄生、炒白芍、枸杞子、續(xù)斷、杜仲、淫羊藿、白術(shù)、熟地黃、仙茅、炙甘草等11味中藥飲片加工制成，具有補(bǔ)腎養(yǎng)胎、健脾養(yǎng)血之功效，臨床用于腎虛型黃體功能不足引起先兆流產(chǎn)和實(shí)施輔助生殖技術(shù)后的助孕安胎治療。補(bǔ)腎安胎顆粒為醫(yī)院制劑，尚無(wú)有效的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，本文采用薄層色譜（TLC）法對(duì)補(bǔ)腎安胎顆粒中的枸杞子、川續(xù)斷、赤芍、淫羊藿和甘草進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)補(bǔ)腎安胎顆粒中的芍藥苷進(jìn)行定量分析，為有效控制補(bǔ)腎安胎顆粒質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATvp島津高效液相色譜儀，SCL-10ATvp檢測(cè)器；KQ-400DE型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；TW20水浴鍋（德國(guó)Julabo公司）。

1.2 樣品與試劑

補(bǔ)腎安胎顆粒（自制，批號(hào)：20180401、20180402、20180403）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ（111685-201707）、芍藥苷（110736-201741）、淫羊藿苷（110737-201516）、黨參炔苷（111732-201607）、甘草苷（111610-201607）齊墩果酸（110709-201808）、毛蕊花糖苷（111530-201713）等對(duì)照品，枸杞子（121072-201611）、杜仲（121202-201103）、白術(shù)（120925-201611）、熟地黃（121196-201406）等對(duì)照藥材，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠GF254板（青島海洋化工廠，批號(hào)：20070927）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎安胎顆粒的制備

取組方的11味中藥飲片，加5倍量水進(jìn)行煎煮，每次煎煮時(shí)間為1 h，共煎煮2次，將煎液合并后給予濾過(guò)處理，隨后濃縮濾液呈稠膏，稠膏相對(duì)密度為1.20～1.25（60 ℃），70 ℃減壓干燥，粉碎，加入甜菊素、糊精適量，混勻，制粒，干燥，制成顆粒，即得。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 枸杞子的薄層鑒別供試品溶液：取適量補(bǔ)腎安胎顆粒，研細(xì)，稱取4 g，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。

對(duì)照藥材溶液：取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水35 mL，煎煮至微沸15 min，放冷，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。

缺枸杞子陰性溶液：取適量缺枸杞子陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)：吸取供試品溶液5 μL、缺枸杞子陰性溶液5 μL、對(duì)照藥材溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）作為展開(kāi)劑，經(jīng)展開(kāi)，取出，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，對(duì)照藥材色譜與供試品色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2.2 續(xù)斷的薄層鑒別供試品溶液的制備：取適量補(bǔ)腎安胎顆粒，研缽研細(xì)，精密稱取4 g，加甲醇40 mL超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀s20 mL使溶解，通過(guò)已處理好的D101型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑為1 cm，柱高為15 cm)，依次以水、30%乙醇、50%乙醇各100 mL洗脫，棄去，再以70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，加入甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即為對(duì)照品溶液。

缺續(xù)斷陰性溶液的制備：取適量缺續(xù)斷陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)：吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL、缺續(xù)斷陰性溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，選取正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖可見(jiàn)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.2.3 炒白芍的薄層鑒別供試品溶液的制備：取補(bǔ)腎安胎顆粒適量，研缽研細(xì)，精密稱取粉末4 g，加甲醇40 mL超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

缺炒白芍陰性溶液的制備：取缺炒白芍陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺炒白芍陰性溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)吸取上述供試品溶液、缺炒白芍陰性溶液15 μL、對(duì)照品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖可見(jiàn)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.2.4 淫羊藿苷的薄層鑒別供試品溶液的制備：同枸杞子的薄層鑒別試驗(yàn)中供試品溶液的制備方法。

對(duì)照品溶液的制備：取淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

缺淫羊藿陰性溶液的制備：取缺淫羊藿陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺淫羊藿陰性溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖可見(jiàn)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.2.5 炙甘草的薄層鑒別供試品溶液的制備：取補(bǔ)腎安胎顆粒適量，研缽研細(xì)，精密稱取粉末4 g，加水20 mL使溶解，離心，取上清液，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（柱長(zhǎng)12 cm，柱內(nèi)徑約1 cm，濕法裝柱，用水50 mL預(yù)洗），用水洗至洗脫液近無(wú)色，再用60%乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。

甘草苷對(duì)照品溶液的制備：另取甘草苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

缺炙甘草陰性溶液的制備：取缺炙甘草陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺甘草陰性溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱數(shù)分，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖可見(jiàn)，對(duì)照品色譜與供試品色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.3 HPLC法測(cè)定補(bǔ)腎安胎顆粒中芍藥苷的含量

2.3.1 溶液的制備對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，加稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，以稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

缺炒白芍陰性溶液的制備：取缺炒白芍陰性樣品適量，照“供試品溶液的制備”方法制備，即得。

2.3.2 色譜條件Diamonsil C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液和缺炒白芍陰性溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)試。芍藥苷保留時(shí)間約在9 min，與其它各峰達(dá)到基線分離，且陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)為3 000以上。色譜圖見(jiàn)圖6。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液（芍藥苷濃度為24.36 μg/mL）30、20、10、8、5、2 μL，注入液相色譜儀中，記錄相應(yīng)色譜圖，橫坐標(biāo)為芍藥苷進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)為峰面積，據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=125 383.360X-5 498.209 0，R2=0.999 9。結(jié)果表明，芍藥苷在0.048 96～0.730 80 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)取芍藥苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD為1.83 %；取批號(hào)20180402的補(bǔ)腎安胎顆粒樣品6份，依法測(cè)定，RSD為0.93 %，本法精密度和重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h后依法測(cè)定，RSD分別為1.69%和1.24%，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的補(bǔ)腎安胎顆粒6份，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液1 mL（每mL含芍藥苷0.675 6 mg），參照供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液，并依法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶液回收率，平均回收率分別為100%、50%、99.96%、98.89%、99.45%、101.08%、100.37%，RSD為0.78%，本法回收率良好。

2.3.8 含量測(cè)定和限度取批號(hào)20180401、20180402、20180403樣品測(cè)定芍藥苷的含量，芍藥苷含量分別為11.6、11.5、11.5 mg/袋（每袋12 g）。

《中國(guó)藥典》2020年版一部炒白芍項(xiàng)下規(guī)定：水分不得過(guò)10.0%，含量按干燥品計(jì)算，含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.2%。本品每1袋中含炒白芍1.668 g，芍藥苷的轉(zhuǎn)移率約為45%?？紤]到大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的損耗等因素，以40%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，本品每袋含芍藥苷為7.2 mg。故擬將本制劑含量限度定為：本品每袋含炒白芍以芍藥苷（C23H28O11）計(jì)，不得少于7.2 mg。三批樣品的含量均符合規(guī)定。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

本制劑君藥為黨參、槲寄生。黨參藥材標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020年版一部［12］收載，該標(biāo)準(zhǔn)中僅有浸出物的測(cè)定，未收載含量測(cè)定方法，由于未有適宜的含量測(cè)定指標(biāo)，故暫未建立黨參的含量測(cè)定方法。槲寄生藥材標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020年版一部收載，該標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定紫丁香苷的含量，含量限度為按干燥品計(jì)算，含紫丁香苷（C17H24O9）不得少于0.04%。以該限度計(jì)算，本制劑中紫丁香苷的含量低于萬(wàn)分之一，不適宜作為本制劑的含量測(cè)定指標(biāo)。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的功效，為本制劑的臣藥之一，芍藥苷為炒白芍中的有效成分，故擬將芍藥苷作為本品的含量指標(biāo)。參照2020年版《中國(guó)藥典》中白芍項(xiàng)下含量測(cè)定方法，采用HPLC法測(cè)定本品中芍藥苷的含量。

3.2 含量測(cè)定波長(zhǎng)的選擇參考相關(guān)研究方法［13-18］，在230 nm波長(zhǎng)處芍藥苷有較強(qiáng)的吸收，選擇230 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)建立了HPLC法測(cè)定補(bǔ)腎安胎顆粒中芍藥苷的含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示峰形對(duì)稱，分離度良好。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的TLC法專屬性強(qiáng)、斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。同時(shí)測(cè)定補(bǔ)腎安胎顆粒中芍藥苷含量的HPLC法，準(zhǔn)確性好、靈敏度高，可以作為補(bǔ)腎安胎顆粒的質(zhì)量控制手段之一。