陳綺婷 李琳

[摘要] 目的 對北京九強生物技術有限公司肌酸激酶同工酶CKMB測定試劑盒（膠乳免疫比濁法）進行性能評價。方法 自2019年5～12月期間采用東芝2000FR全自動生化分析儀，檢測肌酸激酶同工酶的準確度、精密度、線性范圍、空白檢測限、最大稀釋倍數、臨床可報告范圍、參考范圍進行實驗性能驗證。統(tǒng)計學方法采用直線相關回歸分析。 結果 北京九強CKMB試劑盒的準確度驗證中測定值與定值的相對偏差分別為0.62%、-2.89%，批內精密度CV分別為1.29%、0.67%，批間精密度CV分別為1.53%、1.14%。線性范圍為0.00～218.36 ng/mL，臨床可報告范圍為0.12～1642.56 ng/mL，隨機抽取的20例健康體檢樣本的測定結果95%在參考值范圍（0.00～5.00 ng/mL）內。 結論 該試劑盒的膠乳免疫比濁法測定肌酸激酶同工酶性能符合要求，可滿足臨床測試要求。

[關鍵詞] 肌酸激酶同工酶;質量法;試劑性能評價;膠乳免疫比濁法;準確度;精密度;線性范圍;參考范圍

[中圖分類號] R446.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）29-0137-04

[Abstract] Objective To evaluate the performance of CKMB Mass Assay Kit（latex immunoturbidimetry） of Beijing Strong Biotechnologies， Inc（BSBE）. Methods From May to December 2019， Toshiba 2000FR full-automatic biochemical analyzer was used to test the accuracy， precision， linear range， dilution multiple， blank and detection limit， maximum valid dilute double， clinical reportable range and reference range of creatine kinase isoenzyme for experimental performance verification. In terms of statistical method， linear correlation and regression analysis was adopted. Results In the accuracy verification of CKMB Mass Assay Kit of BSBE， the relative deviation of the measured value and the fixed value was respectively 0.62% and -2.89%， the intra-batch precision（CV） was respectively 1.29% and 0.67%， and the inter-batch precision（CV） was respectively 1.53% and 1.14%. The linear range was from 0.00 to 218.36 ng/mL， and the clinical reportable range was from 0.12 to 1，642.56 ng/mL. 95% of the measured results of 20 randomly selected health checkup samples were within the reference value range（0.00-5.00 ng/mL）. Conclusion The latex immunoturbidimetry of the assay kit meets the requirements for creatine kinase isoenzyme determination and it can meet the requirements of clinical test.

[Key words] Creatine kinase isoenzyme; Mass method; Evaluation of reagent performance; Latex immunoturbidimetry; Accuracy; Precision; Linear range; Reference range

磷酸肌酸激酶主要存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，其同工酶（CKMB）是心肌損傷的特異而敏感的指標，曾認為是診斷心肌梗死和心肌炎的金指標[1]。目前實驗室CKMB的檢測方法常為酶法（免疫抑制法），此方法容易出現(xiàn)結果與臨床不符的情況。CKMB質量法，其原理是利用單克隆抗體技術和化學發(fā)光或熒光免疫的方法直接檢測CKMB的質量濃度，所以可以從根本上解決酶法的不足。膠乳免疫比濁法在臨床上測試不需要特殊儀器設備，其檢測方法具有簡便、無污染且測試速度快等優(yōu)點。本研究對北京九強膠乳免疫比濁法測定的肌酸激酶同工酶的試劑盒進行性能評價，以驗證該產品的可靠性和臨床適用性。

1材料與方法

1.1儀器及試劑

1.1.1 儀器? 東芝公司生產的TBA2000FR全自動生化分析儀。

1.1.2試劑、校準品和質控品? 方法學評價所用試劑、校準品和質控品均由北京九強生物科技股份有限公司提供，質控品1和質控品2（批號：19-0114），質量法所用試劑（批號：19-0114），校準品（批號：19-0114）。

1.2 檢測原理

樣本中的肌酸激酶同工酶（CKMB）與超敏化的抗肌酸激酶同工酶（CKMB）抗體膠乳顆粒試劑反應，形成免疫復合物，在660 nm波長處檢測其吸光度的變化，其變化程度與樣本中的肌酸激酶同工酶（CKMB）濃度呈正比。

1.3 檢測參數

樣本體積為10 μL，試劑1（R1）為150 μL，試劑2（R2）為50 μL，采用兩點終點法，反應方向為向上反應，主波長為660 nm，無副波長，反應溫度為37℃，讀點時間：22點/33點。

1.4 方法

1.4.1準確度? 重復測定高低質控樣本，檢測4次，計算其相對偏差。當相對偏差≤10%時，說明該試劑有良好的準確度。

1.4.2精密度? 根據CLSI EP5-A2[2]要求，選擇高低濃度樣本進行批內精密度和批間精密度的測定。批內精密度：取高、低值兩個水平的患者混合血清各1支重復檢測20次，計算均值與標準差，求得變異系數;批間精密度：取高、低值兩個水平的質控各1支，分成5份，每天測4次，連續(xù)測5 d，計算均值與標準差，求得變異系數。

1.4.3線性范圍? 根據CLSI EP6-A[3]要求，取接近檢測上限的血清標本（H）與去離子水（L），按照濃度梯度 H、4 H■1 L、3 H■2 L、2 H■3 L、1 H■4 L、L 等距稀釋，每個濃度梯度測定 2 次，以實測均值為 Y，理論值為X，求出線性回歸方程，并計算Pearson相關系數r值，判定要求：R2≥0.975，0.97≤A≤1.03。

1.4.4空白檢測限? 連續(xù)檢測去離子水10次，計算均值及標準差，以均值+3×SD對應的濃度為試劑空白檢測限。

1.4.5最大稀釋倍數 選取分析范圍內高濃度標本，要求外觀清澈，無溶血，無黃疸，無脂血。用原廠技術資料申明的稀釋液進行2、4、8、16倍稀釋。將檢測結果與稀釋后的預期值進行比較，計算稀釋回收。稀釋回收率=（實測值/預期值）×100%。結果評價標準：稀釋測定結果與理論結果的差異應<±1/2 CLIA'88允許變異（如果CLIA'88上未規(guī)定按照 10%的標準處理）。

1.4.6臨床可報告范圍? 空白檢測限～分析測量范圍上限（已驗證的線性范圍上限×最大稀釋倍數）。

1.4.7參考范圍 隨機選擇2019年5月26日廣州中醫(yī)藥大學順德醫(yī)院健康體檢的20份標本進行檢測。其中男、女各10例，年齡分布合適。根據NCCLS C28-A2[4]要求，如果20個參考個體中不超過2個標本的檢測值在驗證的參考限之外，廠商或提供參考區(qū)間的實驗室報告的 95%參考區(qū)間可以接受。如果出現(xiàn)3個以上超出界限，再選擇20個標本進行驗證，若少于或等于2個檢測值超過原始參考值，則可接受，若還有3個超出參考限，需要重新檢查各種條件，決定是否建立自己的參考區(qū)間。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用Microsoft excel 2013辦公軟件進行數據的統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1準確度實驗評價結果

高低值2個濃度質控品的相對偏差分別為0.62%、-2.89%，兩個相對偏差均符合要求。見表1。

2.2 精密度評價實驗結果

根據WS/T 420-2013（臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證）[5]的要求，低、高值混合標本的批內精密度CV分別為1.29%、0.67%，其CV未超過 1/4TEa（TEa=30%）即7.5%允許偏差范圍，見表2。低、高水平質控品的批間精密度CV分別為1.53%、1.14%，其CV也未超過1/3TEa（TEa=30%）即10%的允許偏差范圍，見表3。

2.3 線性范圍實驗結果

肌酸激酶同工酶的實測值與理論值無明顯離群值，該試劑實測值與理論值的線性回歸方程為Y=1.0087X-0.1157，R2=0.9992。CKMB在0.00～218.36 ng/mL范圍內呈線性，與制造商給定的線性范圍的0.00～180 ng/mL相比，該試劑具有較寬的線性范圍，見表4、圖1。

2.4 空白檢測限實驗結果

以水空白為樣品檢測10次后得出空白檢測限為0.12 ng/mL。見表5。

2.5 最大稀釋倍數實驗結果

將檢測值為 205.32 ng/mL的樣本進行2、4、8、16倍稀釋，將檢測結果與稀釋后的預期值進行比較，計算回收率和相對偏差。當稀釋16倍時相對偏差為-10.60%，大于10%的標準，所以稀釋16倍不可接受，因此該項目的最大稀釋倍數為8倍。

2.6 臨床可報告范圍實驗結果

由表5～6可知，該試劑的臨床可報告范圍為0.12～1642.56 ng/mL。

2.7 參考范圍評價實驗結果

通過對上述20份樣本進行檢測，測定結果中有19個結果均在參考區(qū)間（0.00～5.00 ng/mL）內，有95%的符合率，證明廠家提供的參考區(qū)間仍適用。

3 討論

CK在人體內存在三種類型，分別為CKMM、CKBB和CKMB，CKMM主要存在于骨骼肌和心肌，CKBB主要存在于大腦，CKMB主要存在于心肌，心肌損傷嚴重時釋放入血。因此，CKMB是診斷急性心肌梗死的重要指標[6-7]。

肌酸激酶同工酶（CKMB）在心肌損傷的酶學檢測中具有重要意義，其具有較高的特異度，且受到臨床的廣泛關注。目前，CKMB的檢測方法包括免疫抑制法、電泳法、酶質量法等，其中以免疫抑制法最為常用，其原理是應用單克隆抗體與CK中的M亞基結合抑制 CKMM（主要在骨骼肌中）及CKMB中M亞基活性的特點，再通過速率法進行CK活性測定。但由于生理性、病理性等因素的影響，常使CKMB出現(xiàn)活性假性升高，干擾臨床對心肌損傷的診斷[8]。如CK-BB、肌激酶（MK）、巨CK-1、免疫球蛋白結合 CK（macro CK）、線粒體CK（mit CK）均能造成血中CKMB活性測定結果的誤差，所以臨床上經常看到CKMB>CK的化驗結果，可見CKMB活性的測定有一定的局限性[9]。一般血清CKMB活性大于CK在惡性腫瘤、急性腦血管病、小兒肺炎、小兒輪狀病毒性腸炎、帶狀皰疹、有機磷中毒等疾病中存在[10]，只有避免此類結果的出現(xiàn)才能更好地迅速診斷疾病，減少對臨床造成的干擾。本實驗使用的質量法試劑盒是建立在單克隆抗體直接識別CKMB抗體的實驗原理上的，抗體的特異性決定其不受CKMM、CKBB、巨CK-1以及線粒體CK的干擾，同時避免了蛋白失活造成的誤差，診斷特異性較抗體酶抑制法有顯著的提高[11]。有研究表明，加入干擾物（CK-MMXK-BB）前后CKMB質量未見明顯變化，說明其不受非典型CK、巨CK-1和CKBB等多因素的影響[12]。其次，由于酶的活力具有一定的衰減性[13]，活性的檢測結果相對來說會存在一定的偏差。但CKMB質量不受酶老化的影響，其檢測特異性高于CKMB活性[14]。同時也有研究表明CKMB質量檢測優(yōu)于CKMB活性檢測，特別是對AMI患者和有較明顯感染的心肌缺血患者的診斷[15]。因此，CKMB質量法的診斷效能會大于CKMB活性的診斷效能，CKMB質量法檢測結果可作為心肌炎特異和可靠的診斷依據[16]。因此對于診斷心肌梗死[17]、心肌炎[18]等患者來說，CKMB質量法優(yōu)于常規(guī)的酶法。